草鱼肠道纤维素降解细菌的分离与鉴定

为更好地弄清草鱼（Ctenopharyngodon idella）肠道纤维素降解细菌的种类,采用羧甲基纤维素（CMC）作为唯一碳源的选择性培养基,分别从草鱼肠道内容物和肠道黏膜中分离到了40株产纤维素酶细菌。16S rRNA基因序列的分析结果显示,大多数产纤维素酶细菌为气单胞菌属（Aeromonas）的种类,其次为肠杆菌属（Enterobacter）的细菌以及未经分离纯培养的细菌（Uncultured bacterium）。进一步研究细菌产纤维素酶能力发现,纤维素酶活性显著性高于其他菌株的分别是A. veronii MC2、A. veronii BC6、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中一种未经分离纯培养的细菌BM3（Uncultured bacterium BM3）和A. jandaei HC9。草鱼肠道中简答气单胞菌（A. jandaei）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）、阴沟肠杆菌（E. cloacae）以及产气肠杆菌（E. aerogenes）是被作为产纤维素酶细菌的首次报道。       

草鱼肠道纤维素降解细菌的分离与鉴定简

为更好地弄清草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道纤维素降解细菌的种类,采用羧甲基纤维素(CMC)作为唯一碳源的选择性培养基,分别从草鱼肠道内容物和肠道黏膜中分离到了40株产纤维素酶细菌。16S rRNA基因序列的分析结果显示,大多数产纤维素酶细菌为气单胞菌属(Aeromonas)的种类,其次为肠杆菌属(Enterobacter)的细菌以及未经分离纯培养的细菌(Uncultured bacterium)。进一步研究细菌产纤维素酶能力发现,纤维素酶活性显著性高于其他菌株的分别是A.veronii MC2、A.veronii BC6、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中一种未经分离纯培养的细菌BM3(Uncultured bacterium BM3)和A.jandaei HC9。草鱼肠道中简答气单胞菌(A.jandaei)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、阴沟肠杆菌(E.cloacae)以及产气肠杆菌(E.aerogenes)是被作为产纤维素酶细菌的首次报道。     

丙二醛对离体草鱼肠道黏膜细胞的损伤作用

以丙二醛为实验材料, 在草鱼Ctenopharyngodon idella肠道黏膜细胞培养液中加入不同浓度丙二醛, 研究丙二醛不同剂量、不同作用时间下对肠道黏膜细胞生长、细胞形态结构及相关酶活性的变化. 结果显示: 添加(1.23-9.89) mol/L丙二醛在3-9h时显著抑制了离体草鱼肠道黏膜细胞生长及存活率, 以6h时抑制程度较为明显, 导致贴壁细胞减少, 细胞集落面积减小, 其中添加4.94 mol/L丙二醛细胞胞浆内脂肪滴沉积, 空泡变性, 同时线粒体肿胀, 核固缩; 丙二醛对细胞分化成熟有抑制, 且增加细胞器膜的通透性, 导致胞浆酶漏出; 6h时丙二醛处理组培养液中GSH-PX、T-AOC活力显著降低(P0.05). 结果表明: 添加(1.23-9.89) mol/L丙二醛对草鱼肠道黏膜细胞产生了损伤, 表现为抑制细胞生长, 改变细胞形态、结构, 导致膜结构破坏, 且作用程度与添加浓度、作用时间呈正相关关系. 研究认为丙二醛对草鱼肠道黏膜细胞具有显著性的损伤作用.       

草鱼肠道酸碱度的研究

胃肠道是一个复杂的消化系统, 每一部分都具有独特的生理特征。酸碱度(pH)是消化道重要的生理指标之一, 其对营养物质的消化、吸收和肠道微生物的生长等具有重要影响。为了研究草鱼在食物消化过程中, 肠道的酸碱度变化, 测定了草鱼肠道食物糜、肠液和黏膜的pH。结果显示, 随着食物的消化, 它们的pH都有下降的趋势。肠道食物糜pH在6.86±0.24到8.43±0.10之间, 肠液pH在7.14±0.22到8.63±0.02之间, 相同时间点相同肠段两者之间的pH差异很小, 并且在实验期间两者的pH变化趋势相同。黏膜pH在6.23±0.04到6.7±0.13之间, 为弱酸性。除了时间点12h外, 相同时间点和相同肠道部位黏膜的pH与食物糜、肠液的pH相比均有显著性差异(P<0.05)。分析发现草鱼摄食食物的pH与上述三相的pH之间均有显著性差异(P<0.05), 研究结果为草鱼消化生理及营养学研究提供了基础资料。     

小龙虾肠道产木聚糖酶细菌的分离与鉴定

【背景】小龙虾肠道微生物是小龙虾降解纤维素和半纤维素的主要驱动力。【目的】研究肠道内细菌的相对丰度,为揭示肠道微生物在小龙虾纤维素降解过程中的作用提供理论支撑。【方法】采用纯培养法从小龙虾肠道筛选产木聚糖酶细菌,并且对小龙虾肠道细菌进行16S高通量测序。【结果】形态学和16SrRNA基因分子鉴定表明,筛选到的4株产木聚糖酶细菌均属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属;结合进一步的生理生化特征鉴定,结果为:菌株Z-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株Z-4为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株Z-29为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),菌株Z-30为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis);16S rRNA基因高通量测序结果表明:在属水平上,小龙虾肠道细菌主要是Candidatus Bacilloplasma、拟杆菌属、弧菌属、不动杆菌属、Dysgonomonas、Tyzzerella3、气单胞菌属和希瓦氏菌属细菌。【结论】小龙虾肠道内细菌资源丰富,且芽孢杆菌属细菌在木质纤维素降解过程中发挥一定功能。     

氧化豆油水溶物对离体草鱼肠道黏膜细胞的损伤作用

以氧化豆油水溶物为试验材料,在草鱼肠道黏膜细胞培养液中加入不同浓度氧化豆油水溶物,研究不同剂量氧化豆油水溶物在不同作用时间下对肠道黏膜细胞生长、细胞形态结构的影响。结果显示: 添加111.06-888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用6h显著降低细胞活性（P0.05）,细胞集落面积减小、细胞形态改变,其中在444.24 g/L氧化豆油的水溶物作用下培养细胞空泡变性,且脂肪滴沉积,线粒体肿胀。在222.12-888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用下,3-9h内培养液中LDH活力显著增高（P0.05）;各时间点培养液中GSH-PX、SOD、T-AOC均有显著变化。结果表明,在培养液中添加111.06-888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用12h内,对草鱼肠道黏膜细胞产生了损伤,表现为抑制细胞生长,改变细胞形态、结构,可能引起细胞膜脂质过氧化,导致膜结构破坏,且作用程度与添加浓度、作用时间相关。研究认为氧化豆油水溶物对草鱼肠道黏膜细胞具有显著性的损伤作用。       

小龙虾肠道产纤维素酶细菌的分离与鉴定

小龙虾肠道微生物是小龙虾降解纤维素和半纤维素的主要驱动力,挖掘小龙虾肠道内降解纤维素的益生菌资源及基因资源。采用纯培养法,从小龙虾肠道筛选产纤维素酶细菌,对高活性菌株进行高通量测序。形态学结合16S rRNA分子鉴定结果显示:菌株13为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株33为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株33具有多种水解酶活性,并有较高的纤维素降解能力,高通量测序结果表明该菌基因组含有许多碳水化合物相关酶基因。小龙虾肠道中含有丰富的纤维素降解菌,芽孢杆菌属细菌占据一定比重。     

池塘养殖条件下草鱼(Ctenopharyngodon idelluspond)肠道黏膜细胞紧密连接蛋白基因表达水平的研究

为了研究肠道损伤与肠道黏膜细胞TJ结构的关系,以池塘养殖条件下的草鱼为研究对象,在对肠道损伤进行外观形态、组织切片和血清指标评估的基础上,分别选取肠道健康和肠道损伤的草鱼,采用荧光定量PCR(RT-QPCR)方法,定量检测了构成肠道黏膜细胞紧密连接结构的9个蛋白基因的表达水平。结果显示:与肠道健康草鱼相比,养殖草鱼肠道损伤后,血清二胺氧化酶(DAO)活性显著增加,同时,肠道黏膜细胞中的跨膜蛋白基因Claudin-3、Claudin-12、Claudinb、Claudinc、Claudin-15a,外周膜蛋白基因ZO-3和闭锁蛋白基因Occludin的表达水平显著下调(p0.05)。结果表明,草鱼肠道损伤会导致肠道黏膜细胞间TJ结构的损伤,从而导致肠道屏障通透性的显著增加。     

氧化鱼油对草鱼肠道黏膜抗氧化应激通路基因表达水平的影响

为了探讨氧化鱼油对草鱼肠道黏膜损伤后, 参与抗氧化应激的基因通路及其通路基因表达活性的变化,以草鱼为试验对象, 灌喂氧化鱼油7d后, 采集肠道黏膜组织并提取总RNA, 采用RNA-seq方法, 进行了氧化鱼油组和正常鱼油组草鱼肠道黏膜基因注释、IPA基因通路分析和基因表达活性差异分析。结果显示, 组织切片观察发现氧化鱼油导致草鱼肠道黏膜出现严重的损伤; 肠道黏膜中具有较为完整的Keap1-Nrf2-ARE基因调控通路。肠道黏膜在受到氧化鱼油的氧化损伤作用后, 激活了细胞的抗氧化损伤保护机制, 使NRF2介导的氧化应激反应通路基因差异表达显著性地上调, 并导致了下游的GSH/GSTs通路基因差异表达显著性上调, 促进了GSH的生物合成和GSTs的抗氧化作用; 导致Keap1-Nrf2-ARE信号通路下游的热休克蛋白和泛素-蛋白酶体通路基因差异表达显著性上调, 清除受损伤蛋白质, 保护细胞结构完整性。研究表明, 上述三类抗氧化应激通路构成了对肠道黏膜损伤细胞、损伤蛋白质的降解系统和清除系统, 显示其对肠道黏膜组织和黏膜细胞的保护、修复发挥了重要的作用。     

灌喂氧化鱼油使草鱼肠道黏膜胆固醇胆汁酸合成基因通路表达上调

以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为试验对象, 灌喂氧化鱼油7d后, 采集肠道黏膜组织并提取总RNA, 采用RNA-seq方法, 进行氧化鱼油组和正常鱼油组草鱼肠道黏膜基因差异表达水平、基因注释和IPA基因通路分析, 并测定了血清中胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量. 研究结果显示, 草鱼肠道黏膜在受到氧化鱼油损伤后, 胆固醇和胆汁酸生物合成通路代谢酶、调节胆固醇和胆汁酸合成或转运的代谢酶或蛋白基因差异表达, 部分基因差异表达达到显著性上调水平. 实验结果表明, 草鱼肠道黏膜具备完整的乙酰辅酶A胆固醇胆汁酸的合成代谢基因通路. 肠道黏膜在受到氧化鱼油损伤后, 以乙酰辅酶A为原料的胆固醇生物合成代谢通路基因表达增强, 胆固醇由细胞外转运到细胞内的逆转运途径基因通路表达下调, 胆固醇由细胞内向细胞外转运基因通路表达上调; 以胆固醇为原料的胆汁酸经典合成代谢途径基因通路表达上调, 而胆汁酸的补充合成途径基因表达下调. 在灌喂氧化鱼油后, 血清胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯含量分别增加了28.84%、29.56%和12.13%, 而高密度脂蛋白含量下降了8.15%.       

草鱼树突状细胞的分离鉴定及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响

为揭示草鱼(Ctenopharyngodon idellus)树突状细胞(Dendritic cells)的生物学特性及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响,研究通过草鱼体外细胞培养技术分离获得草鱼DCs,对其形态学特征、生物学功能及膜表面标记分子的表达进行了分析鉴定; RT-PCR检测了益生芽孢杆菌对草鱼DCs免疫相关细胞因子表达的影响。结果表明草鱼DCs具有典型的树突状形态,可有效地激活T淋巴细胞的增殖并具有迁移能力。LPS刺激可促进其成熟过程,显著提升膜表面标记分子CD80/86、CD83的表达。这表明草鱼DCs和哺乳动物DCs在形态和功能上具有高度相似性。RT-PCR结果显示,在体外条件下使用紫外照射灭活的益生枯草芽孢杆菌对草鱼DCs进行刺激后,抗炎性因子IL-4, IL-10的表达水平显著提升(P<0.05),并在12h时达到峰值。这表明枯草芽孢杆菌可通过促进树突状细胞分泌抗炎性因子来影响其免疫功能。以上结果为进一步研究鱼类树突状细胞的生物学特性及益生芽孢杆菌对其免疫功能的影响提供了重要的依据。     

饲料中发酵芝麻粕替代菜粕对草鱼生长性能、肠道形态和微生物及小肽转运相关基因表达的影响

实验以初重(99.98±0.69) g的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为研究对象, 研究饲料中发酵芝麻粕替代菜粕蛋白对草鱼生长性能、肠道形态和微生物以及小肽转运相关基因表达的影响。添加0、5%、10%和15%发酵芝麻粕分别替代菜粕蛋白0、11.8%、23.5%和35.1%, 配制4组等氮等脂的饲料, 分别为对照组、实验1组、实验2组和实验3组。实验在室内循环水养殖系统中进行, 每组3个重复, 每一重复饲喂20尾鱼, 每天饱食投喂2次, 实验共持续45d。结果发现: 各处理组间草鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率均无显著差异, 实验1组和2组略高于对照组(P>0.05); 组间饵料系数也无显著差异, 实验1组和2组略低于对照组(P>0.05)。实验组草鱼肠绒毛高度均显著高于对照组(P<0.05), 而实验组隐窝深度小于对照组 (P>0.05), 绒毛高度与隐窝深度的比值(V/C)在实验组也显著高于对照组(P<0.05)。随着发酵芝麻粕替代比例的增加, 乳酸杆菌(Lactobacillus)和芽孢杆菌(Bacillus)占比显著上升(P<0.05), 而大肠杆菌(Escherichia coli)和气单胞菌(Aeromonas)占比显著下降。小肽转运相关基因方面, 尾型同源盒基因2 (CDX2)、特异性蛋白1 (Sp1)和小肽转运蛋白1 (PepT1)基因mRNA相对表达量均随着发酵芝麻粕替代比例的增加呈现先显著上调后下调的趋势, 且均在实验1组时达到最大值(P<0.05)。综合考量鱼体生长性能、肠道黏膜形态、菌群及小肽转运相关基因表达方面, 草鱼饲料中发酵芝麻粕蛋白适宜替代菜粕蛋白的比例为11.8%—23.5%。     

睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

为研究睡美人(Sleeping Beauty, SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性, 构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统, 以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统; 通过转染CIK细胞, 用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞, 测定DsRed转染效率和整合效率, 并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列。结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1﹕2时, 外源基因DsRed的整合效率最高; SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处。研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础。     

越冬胁迫对草鱼抗氧化能力及脂肪酸组成的影响

为了探讨草鱼(Ctenopharyngodon idellus)越冬期间氧化应激状况及其与组织脂肪酸比例变化的关联性,将草鱼[初始体重(1053.33±16.11) g]分别置于室外水泥培育池,自然越冬处理0、1周、2周、4周、8周、12周和16周后,进行生物学性状指标,肝胰脏、肌肉、前肠、脂肪组织和血清抗氧化能力指标及肝胰脏、肌肉、脂肪组织脂肪酸比例的测定,同时进行了抗氧化能力指标与脂肪酸比例间的关联性分析。结果表明,在越冬期间,草鱼机体体重、肝胰脏重量、肥满度、肝体比、脏体比、肠体比和腹腔脂肪指数均发生显著下降(P<0.05);但是肾指数和脾指数显著上升(P>0.05)。氧化胁迫应激最大的3个组织分别是脂肪组织、肝胰脏和肌肉。肝胰脏PUFA比例对总体脂肪酸比例产生了主要的影响(主成分载荷特征值>0.5),肌肉C18:2n-6和C16:0比例对总体脂肪酸组成产生主要影响,脂肪组织中的PUFA、n-6PUFA、SFA和MUFA比例对总体脂肪酸比例产生了主要影响;关联分析表明草鱼脂肪组织中SFA在越冬期间供应能量同时,与氧化应激乃至机体损伤显示正相关关联性,肌肉中PUF...     

鲤、青鱼肠粘膜内分泌细胞的免疫组织化学鉴别和定位

使用过氧化物酶——抗过氧化物酶(PAP)的免疫组织化学染色技术,用10种哺乳动物激素培育出的抗血清对鲤、青鱼肠道粘膜中内分泌细胞的鉴別表明,它们的肠道粘膜上皮中存在有胃泌素、P物质、牛胰多肽、亮氨酸脑啡肽、胰高血糖素样免疫反应物、抑胃多肽等6种免疫活性內分泌细胞;而五羟色胺、胆囊收缩素和神经降压素没有免疫活性反应。在鲤的肠粘膜中存在生长抑素免疫活性内分泌细胞;青鱼中则未见到这种细胞。两种鱼的各种免疫活性內分泌细胞多数在前肠的分布密度较大;但青鱼肠粘膜中P物质和亮氨酸脑啡肽两种免疫活性内分泌细胞却在直肠中分布最多;胰高血糖素样免疫活性内分泌细胞在中肠分布最多。P物质和胃泌素免疫活性內分泌细胞大多数分布于肠褶顶部;其他各种免疫活性內分泌细胞则主要分布于肠褶的中、底部。本文比较了鲤、青鱼的肠内分泌细胞在各肠段中的分布密度,并对其形态学及分布特点进行描述和讨论。     

池塘循环水养殖对混养草鱼食用品质的影响

为探究养殖模式对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼肉品质的影响,实验对两种养殖模式下(传统池塘养殖和池塘循环水养殖)草鱼的食用品质进行了差异比较。结果表明,循环水养殖草鱼肌肉白度和弹性高于传统池塘养殖的草鱼,且其不饱和脂肪酸和必需氨基酸含量均显著高于传统池塘养殖;其中, n-3和n-6系列不饱和脂肪酸含量显著高于传统池塘养殖草鱼,是其1.2倍,使得草鱼的肌肉品质和营养品质更佳。此外,循环水养殖可降低草鱼中带有土腥味和青草味的己醛、庚醛和1-辛烯-3-醇等物质的含量,且鲜味核苷酸(IMP)含量高于传统池塘养殖草鱼,使得草鱼的风味更鲜美、浓厚。研究表明,循环水养殖草鱼的肌肉品质和营养特性均优于传统池塘养殖。     

基于微单体型分子标记的草鱼亲子鉴定方法

研究选择一种新型分子标记——微单体型用于亲子鉴定,构建了高效的标记筛选和亲子鉴定流程,并以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为例评估了该亲子鉴定方法的效果。结果表明,利用基因组重测序数据能够准确完成微单体型标记的分型,效果和适应性明显优于传统的基于群体遗传学推断的分型;通过信息熵的大小能够高效筛选微单体型标记组合, 3个和5个微单体型标记的亲子鉴定结果与微卫星序列(SSR)鉴定结果的一致性分别达到97.08%和99.42%。研究表明使用微单体型分子标记可以快速而准确地完成鱼类的亲子鉴定工作。     

个体大小对草鱼耐高温能力及升温过程中群体行为的影响

为考察个体大小对升温过程中草鱼的耐高温能力和群体行为的影响, 研究以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)幼鱼为实验对象, 结果显示: 大个体群体的个体游泳速度明显大于小个体群体(P=0.039), 个体间距离和最近邻距离显著高于小个体群体(P<0.001); 大个体鱼群的极性与小个体群体并无差异。虽然大个体群体的致死高温与小个体群体无差异, 但前者的临界高温显著大于小个体群体(P<0.001)。升温过程会使鱼群个体游泳速度变快, 个体间距离和最近邻距离也相应增加, 但游泳速度同步性和群体极性维持不变。研究表明: 个体大小的增加可增强草鱼幼鱼对环境水温的耐高温能力; 升温不会影响不同个体大小草鱼幼鱼群体的协调性, 但会降低草鱼幼鱼的群体凝聚力。     

纳米缓释丁酸钠对草鱼生长性能、血清生化指标、肠道黏膜形态及PepT1基因表达的影响

以初始体重(18.65±0.21) g的草鱼为实验对象,研究不同浓度纳米缓释丁酸钠对草鱼的生长性能、血清生化指标、肠道黏膜形态及PepT1基因表达的影响,实验共配制6种等氮等能的草鱼实验饲料,在基础饲料中分别添加0、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%和0.8%的纳米缓释丁酸钠,以不添加丁酸钠组为对照组。实验在室外网箱内进行,每网箱饲养50尾草鱼,每个处理重复3次,养殖时间60d。结果表明:当纳米缓释丁酸钠添加量为0.6%时,草鱼的增重率、特定生长率、肥满度和肠绒毛高度均显著高于对照组(P<0.05),具有较好的促进生长的作用;同时,草鱼血清中的球蛋白含量显著增加(P<0.05),尿素氮含量与对照相比显著降低(P<0.05),谷丙转氨酶GOT、谷草转氨酶GPT及葡萄糖含量与对照相比差异不显著;血清中总氨基酸含量及必需氨基酸含量相比对照组增加显著(P<0.05),小肠中PepT1基因表达量提高显著(P<0.05)。在饲料中添加适量的纳米缓释丁酸钠通过保护肠道黏膜和提高肠道PepT1的表达量,从而促进其生长,适宜添加量为0.6%。     

感染草鱼呼肠孤病毒对肠道菌群多样性的影响

为揭示草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道菌群的影响, 在通过人工浸泡方式感染GCRV后, 采用针对16S rRNA基因的高通量测序技术对草鱼肠道菌群的组成和多样性进行了研究。结果显示, 感染组与对照组差异显著(MRPP, Anosim, Adonis, P<0.01), 且感染组肠道菌群的Alpha多样性指数(Shannon-Wienner、Inverse Simpson、Pielou evenness)显著低于对照组(t-test, P<0.05)。此外, 肠道菌群在感染组个体间差异显著大于对照组(Wilcoxon test,P<0.05), 表明患病草鱼肠道菌群失去原有平衡而变得紊乱。尽管病毒感染组和对照组草鱼肠道优势菌门均为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria, 但在OTU水平仍表现出明显的变化, 如OTU_69(Pasteurellaceae)、OTU_504(Comamonadaceae)和OTU_1898(Cetobacterium)在感染GCRV组丰度显著降低(t-test, P<0.05), 也表明GCRV感染可使草鱼肠道微生态发生紊乱。肠道菌群结构稳定对于宿主健康具有重要意义, 研究患病鱼肠道菌群状况为鱼类常见疾病的防控提供科学依据, 也为健康养殖提供参考。