文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用, 研究通过已构建的文蛤转录组文库, 利用SMARTRACE技术扩增得到文蛤HDAC1 (Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列, 分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征, 并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示, Mm-HDAC1基因的cDNA全长3065 bp, 开放阅读框1599 bp, 编码532个氨基酸; 氨基酸序列比对发现, 文蛤与其他物种同源性为74.3%78.7%。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达, 其中外套膜中的表达量相对最高, 并与其他组织间有极显著差异(P0.01); 不同发育时期的表达差异结果表明, Mm-HDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高, 显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明, 在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点, 其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。     

青蛤抗菌肽基因的克隆及其在组织间的表达分析

利用构建的SMART-cDNA文库及高通量测序方法,获得了青蛤抗菌肽macin家族相关基因(mytimacin)的全长序列,采用荧光定量PCR方法分析了mytimacin在青蛤各组织的表达情况,并在鳗弧菌胁迫下分析了mytima-cin在外套膜中的时序表达关系。结果表明,mytimacin基因全长461bp,开放阅读框为261bp,编码86个氨基酸,具有24个氨基酸的信号肽序列;荧光定量PCR结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃和闭壳肌等组织中普遍表达,其中外套膜表达水平最高,在鳃中表达最低;在鳗弧菌刺激后6～24h,青蛤外套膜中mytimacin的表达量出现明显上调的趋势且与对照组差异显著(P<0.05),说明mytimacin抗菌肽基因在青蛤的免疫反应中具有重要作用。     

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达性分析

采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp。PmSTARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)STARDL3的序列的相似度最高。SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域。荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p0.05)。     

文蛤Smad1/5基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用, 利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列, 对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析, 并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性。结果表明: Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸; 氨基酸多序列比对显示, Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%, 与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad1、Smad5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上, 说明该基因具有较高的保守性; 结构域预测发现, Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明, Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达, 尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升。Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明, 共发现了9个SNP位点, 其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05)。Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础。     

马氏珠母贝载脂蛋白基因Pm-APOL3克隆、表达量与类胡萝卜素含量相关分析

Apolipoprotein L3(APOL3)是新发现的一种高密度脂蛋白,属于载脂蛋白L基因家族的成员之一,具有运载脂类物质进行生化代谢的功能。本研究利用c DNA末端快速扩增技术获得了马氏珠母贝APOL3基因(Pm-APOL3)c DNA全长序列,分析其序列及功能特征,检测Pm-APOL3基因在不同组织的表达,并分析了金黄壳色群体与养殖群体类胡萝卜素含量与Pm-APOL3基因表达量的相关性。结果表示,Pm-APOL3基因c DNA全长874 bp,开放阅读框(ORF)为357 bp,编码118个氨基酸,包含475 bp的5'UTR,42 bp的3'UTR,相对分子量为12.795 5 ku,等电点为4.71。该蛋白质的不稳定指数为34.09,属于稳定蛋白质,疏水性分析表明其亲水性平均系数为0.74,属疏水蛋白,信号肽预测结果表示其不含信号肽,为非分泌蛋白。荧光定量PCR分析表明Pm-APOL3基因在鳃、外套膜、闭壳肌与肝胰脏均有表达,其中肝胰脏表达量显著大于其它三个组织(p0.05)。金黄壳色群体类胡萝卜素含量与Pm-APOL3基因表达量均显著大于养殖群体(p0.05)。本研究结果表明Pm-APOL3是参与马氏珠母贝类胡萝卜素代谢重要基因。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析

基于RACE技术克隆得到尾巨桉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(EuHMGR)基因全长为1955bp,包含1560bp的开放阅读框(ORF),编码519个氨基酸。生物信息学分析表明EuHMGR包含两个HMG-CoA结合基序和两个NADP(H)结合基序;同源建模得到EuHMGR三维构象呈"V"型,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域。将EuHMGR组DNA与cDNA序列进行比对表明EuHMGR存在一个319bp的内含子。通过实时定量PCR进行组织特异性表达分析表明EuHMGR在茎中的表达量最高,叶次之,在根中基本无表达。该研究为后续尾巨桉EuHMGR的功能验证以及遗传转化奠定基础。     

马氏珠母贝PmCOLVIA6基因的克隆和表达分析

collagenⅥ(COLⅥ)是胶原蛋白家族的重要成员,广泛分布于动物体细胞外基质,在脊椎动物骨骼形成过程中发挥重要作用。为了探究COLⅥ在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究运用聚合酶链式反应(PCR)和c DNA末端快速扩增技术(RACE)获得了马氏珠母贝Pm COLVIA6基因的全长序列,克隆获得其启动子区域,并对其蛋白结构进行了分析。荧光定量PCR技术检测了该基因在马氏珠母贝各个组织的表达量分布,并利用原位杂交技术检测Pm COLVIA6基因在外套膜的表达定位。结果表明:Pm COLVIA6序列全长为2 100 bp,开放阅读框(ORF)长为1 875 bp,编码624个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长56 bp,3'非翻译区(3'UTR)长169 bp,于5'调控区克隆得到长为1 826 bp的序列,可能存在4个启动子序列。Pm COLVIA6蛋白含有典型的v WA结构域,但三股螺旋结构缺失。荧光定量分析表明Pm COLVIA6基因在马氏珠母贝的各个组织均有表达,而在珍珠囊和外套膜中央区的表达量显著高于其它组织。原位杂交结果显示Pm COLVIA6的m RNA主要分布于外套膜中央区的外表皮细胞。综上所述,Pm COLVIA6可能参与马氏珠母贝珍珠层的形成。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEXL基因的分子特征与表达分析

几丁质作为有机框架主要成分参与贝壳的形成。β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase, HEX)属于糖苷水解酶家族20,在几丁质水解过程发挥重要作用。为了探究Pm HEXL在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得Pm HEXL基因c DNA全长序列并检测其在不同组织的表达模式。研究显示,Pm HEXL基因序列全长2 760 bp,其中5'UTR为167 bp,3'UTR为268 bp,开放阅读框(ORF)为2 325 bp,编码774个氨基酸;预测其相对分子量为89.59 kD,理论等电点为5.93;SMART软件分析PmHEXL蛋白质序列,发现它具有典型的GH20、GH20b结构域和CHB-HEX结构域;多序列比对结果显示Pm HEXL与其它物种的HEX具有较高的保守性;qPCR表达分析显示Pm HEXL在外套膜套膜区表达量最高,边缘区次之。综上所述,Pm HEXL可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程。     

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低; HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。     

三角帆蚌Hc-GSK3β基因鉴定及内壳色性状相关SNP筛选

为了探究三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)糖原合成激酶-3β(GSK3β)基因对壳色的影响,研究采用RACE技术获得Hc-GSK3β基因cDNA全长1867 bp,其中包含1261 bp的ORF区编码420个氨基酸, ORF中含有一个S＿TKc结构域,该结构域序列高度保守。组织差异表达分析发现Hc-GSK3β基因在紫色蚌鳃、斧足、内脏团和边缘膜组织中表达量高于白色蚌的表达量(P<0.05),且在斧足和边缘膜表达差异水平达到极显著(P<0.01),而在紫色蚌闭壳肌组织中表达量显著低于白色蚌(P<0.05)。原位杂交(ISH)实验结果显示在三角帆蚌外套膜的外褶、中褶、內褶、背膜区和腹膜区均有阳性信号产生,且在外褶的信号表达较强烈。该基因经重测序比较,共鉴定出6个SNP位点,其中在C+185A位点的CA基因型在紫色蚌的分布频率显著高于白色三角帆蚌(P<0.05);在紫色蚌中, T+341G位点TT基因型三角帆蚌内壳颜色参数b值显著低于TG基因型(P<0.05)。研究表明, Hc-GSK3β基因参与了三角帆蚌壳色形成,筛选的SNP标记可用于三角帆蚌壳...     

miR-139555及其靶基因PtNBC在三疣梭子蟹适应盐度胁迫中的表达调控

为研究miR-139555及其潜在靶基因PtNBC(碳酸氢钠协同转运基因)在三疣梭子蟹(Portunus tritu-berculatus)适应盐度胁迫中的表达调控分析,利用RACE技术克隆了PtNBC基因,该基因全长5308 bp,开放阅读框(ORF)3570 bp,共编码1189个氨基酸.利用RT-PCR技术分析m...     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

翘嘴鲌胰岛素样生长因子igf3基因的克隆及表达分析

为研究翘嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor 3,igf3)基因在性别调控过程中的作用,基于分子克隆手段RT-PCR和RACE技术相结合方法扩增到翘嘴鲌igf3基因完整cDNA序列,利用qRT-PCR技术检测其在不同组织中的表...     

脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因的克隆及表达分析

应用RACE技术克隆脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因, 并通过攻毒实验揭示脊尾白虾血蓝蛋白基因的先天免疫防御作用, 为脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的免疫防治研究提供依据和思路。研究成功克隆了脊尾白虾血蓝蛋白大亚基基因全长cDNA序列, 该大亚基cDNA全长 2192 bp, 开放式阅读框长 2034 bp, 5′非编码区长 21 bp, 3′非编码区长 137 bp, 将该基因命名为 EcHcL。EcHcL编码 667 个氨基酸, 前 21 个氨基酸组成信号肽, 推测成熟肽的分子量为 78.5 kD。Blast比对结果显示, 由脊尾白虾血蓝蛋白EcHcL序列推导的氨基酸序列与日本沼虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白氨基酸序列的同源性分别达到 87%、73%, 其M结构域氨基酸序列与斑节对虾、日本对虾等物种同源性性高达 90% 左右, 由此推断该cDNA序列属于血蓝蛋白家族。组织表达分析结果显示, EcHcL基因在脊尾白虾鳃、卵巢、肝胰腺、心脏、肠、肌肉、胃、腹神经节、眼柄、血细胞中均有表达, 肝胰腺中相对表达量最高。Real-time PCR分析发现EcHcL基因在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后脊尾白虾肝胰腺和血细胞中的表达量显著增加, 并具有不同的时空表达模式, 推测脊尾白虾EcHcL基因在免疫防御中具有重要作用。     

日本对虾Bcl-2基因的cDNA克隆与抗寒功能研究

为研究B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma, Bcl-2) 基因在内源性细胞凋亡通路中发挥的重要调控作用, 实验利用cDNA末端快速扩增(RACE) 技术克隆获得日本对虾(Marsupenaeus japonicus)MjBcl-2 基因cDNA全长序列, 并对其序列进行生物信息学分析; 利用实时定量PCR (qPCR) 技术分析了MjBcl-2在不同组织、不同水温胁迫及RNA干扰后的表达水平; 同时利用TUNEL技术, 检测MjBcl-2 干扰后的细胞凋亡情况。结果显示: 日本对虾MjBcl-2 cDNA全长为2432 bp, 开放阅读框长度为726 bp, 共编码241个氨基酸, 分子量为26.80 kD; 结构域预测分析表明MjBcl-2 含有Bcl-2家族典型的保守结构域; 多序列比对以及进化树构建结果表明, MjBcl-2与其他物种的相似度较高, 保守性较强。定量PCR结果显示, MjBcl-2在日本对虾各个组织中均有表达, 肌肉中表达量最高, 鳃次之, 心脏中表达量最低。低温(10℃和16℃)胁迫下日本对虾鳃和肝胰腺Bcl-2基因的表达量逐渐上升, 在72h到达最高点; 在干扰Bcl-2基因后, 各个温度Bcl-2基因的表达量均下调, 细胞凋亡基因Caspase-3的表达量显著上调(P<0.05) 。TUNEL检测结果表明, RNAi组和NC组(对照组) 随着温度的降低, 凋亡细胞数量不断增加, 在28℃处理组中有少量凋亡细胞, RNAi组与NC组凋亡细胞的数量没有明显的变化, 在10℃低温处理组中, RNAi组凋亡细胞的数量明显高于NC组; 12h后, 28℃ NC组、28℃ RNAi组、10℃ NC组和10℃ RNAi组中鳃组织的细胞凋亡率分别为1.73%、2.35%、21.59%和33.70%。研究表明, MjBcl-2在日本对虾应对低温胁迫中发挥重要作用。     

三角帆蚌GPX基因cDNA全序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

根据本实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)基因cDNA全序列。序列分析表明, 该基因cDNA序列全长1286 bp, 包括5′端非翻译区(Untranslated Region) 39 bp、3′端非翻译区659 bp和开放阅读框(Open reading frame, ORF)588bp, 共编码195个氨基酸, 分子量约为22.2 kDa, 理论等电点为8.44, 属于含硒类GPX。该氨基酸序列具有GPX所有亚型中均高度保守的3个环状结构, 对酶的三级结构起稳定作用。在线分析结果表明: GPX的氨基酸序列不存在明显的疏水区, 也不存在信号肽序列。氨基酸相似性对比结果显示, 三角帆蚌GPX氨基酸序列与脊椎动物GPX-2及GPX-1的序列相似度较高, 为73.1%-80.8%, 与其他型GPX相似度较小, 相似度低于60%。构建的系统进化树显示三角帆蚌GPX与其他几种鱼类GPX聚为一类, 与其他已发表的几种软体动物GPX相距较远, 推测本实验克隆的三角帆蚌GPX基因和已发表的软体动物不属于同一种GPX类型。     

中华鳖转铁蛋白基因序列特征及表达研究

转铁蛋白是呼吸链的关键因子, 参与体液和免疫系统的调节, 具有抗菌抗病毒等功能。研究从嗜水气单胞菌诱导的中华鳖肝脏SMART cDNA文库中, 分离克隆了中华鳖转铁蛋白基因cDNA和gDNA全序列, 对其序列特征、组织表达及原核表达进行了分析研究。结果显示, 中华鳖转铁蛋白对应全长cDNA的基因组DNA全长为19100 bp, 由17个外显子和16个内含子组成; cDNA全长为2359 bp, 开放阅读框为 2094 bp, 编码697个氨基酸; 转铁蛋白的分子量为76.6 kD, 包含2个糖基化位点, 存在4个二硫键形成区域的缺失, 两个同源结构域的相似性为37%, 信号肽位于第119位点。荧光定量PCR结果显示, 正常组中华鳖转铁蛋白基因在肝脏中的表达量最大; 以嗜水气单胞菌刺激后, 其在心、肝、脾和肾脏组织中的表达, 均有一个上调后减少的趋势。此外, 实验还进行了重组转铁蛋白原核表达和Western blot 检测鉴定, 为深入研究中华鳖转铁蛋白功能的提供了基础数据。