半滑舌鳎AKT-ineracting protein基因的克隆及免疫应答表达分析

研究克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis膜蛋白AKT-interacting protein (AKTIP)基因, 研究了其在健康组织中的表达模式、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后免疫组织和不同病原物刺激外周血淋巴细胞中的表达特征。通过常规克隆和RACE技术, 获得的半滑舌鳎AKTIP基因全长cDNA序列为1224 bp, 其中包括5'-UTR为116 bp, 3'-UTR为117 bp和完整的ORF序列891 bp, 编码296个氨基酸, 预测蛋白质的等电点(PI)为9.12,分子量是33.74 kD; 同源比对发现半滑舌鳎AKTIP的氨基酸序列在不同物种之间具有较高的保守性; 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)检测到半滑舌鳎各个组织中均有AKTIP基因的表达, 在卵巢中表达量最高; 鳗弧菌感染半滑舌鳎后, AKTIP基因在肝、鳃、血液、肠、头肾和脾中均上调表达; 病原模拟物PGN、LPS、poly I:C和WGP刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞均诱导AKTIP基因下调表达。研究表明半滑舌鳎AKTIP基因参与了机体免疫反应为给半滑舌鳎免疫防御技术的研究提供理论依据。     

半滑舌鳎血淋巴细胞体外培养及其染色体制备在性别鉴定中的应用

研究建立了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gnther)外周血淋巴细胞体外培养及染色体制备方法,确定了最佳条件为:在24℃的环境中半滑舌鳎血淋巴细胞在添加20%胎牛血清的MEM培养基中,用终浓度为0.3 mg/mL的LPS为刺激源培养72h,在结束培养前3h加入终浓度0.08g/mL秋水仙素,可获得较多、较好的染色体分裂相。利用这种方法对半滑舌鳎遗传性别进行了鉴定,同时与生理解剖观察、性腺切片、性腺细胞培养、雌性特异标记等方法进行了比较,确定了适宜各阶段不同类型鱼的性别鉴定方法,丰富了半滑舌鳎活体遗传性别鉴定的方法。       

半滑舌鳎miR-200a和miR-200b前体克隆及其免疫应答分析

为了探究半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）miR-200a和miR-200b在免疫应答中的作用,采用PCR方法克隆了半滑舌鳎miR-200家族的miR-200a和miR-200b的前体序列,长度分别为82和88 bp;用The mfold Web Server和Clustalx1.83软件对其前体序列进行了二级结构和同源性分析,miR-200a和miR-200b都具有典型的颈环结构,与其他物种具有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,miR-200a和miR-200b在健康半滑舌鳎13种组织（肝脏、肠、脾脏、头肾、后肾、鳃、血液、脑、皮肤、肌肉、胃、心脏和卵巢）中均有表达,miR-200a在头肾中表达量最高,在血液中表达量最低,miR-200b在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低;miR-200a和miR-200b在鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染半滑舌鳎后不同时间点的4种免疫相关组织（肝脏、肠、脾脏和头肾）中的表达呈现出先上调后下降的规律,但表达达到峰值的时间点有所不同。miR-200a在肝脏和脾中的表达峰值出现在鳗弧菌感染后6h,在肠和头肾中则是鳗弧菌感染后12h,miR-200b在肠、脾和头肾中均在鳗弧菌感染后12h达到表达高峰;miR-200a和miR-200b在脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、葡聚糖（WGP）、聚肌胞苷酸（poly I:C）4种病原模拟物刺激后的半滑舌鳎肝脏细胞系中呈现出上调表达趋势,其中Poly I:C刺激半滑舌鳎肝脏细胞系后miR-200a上调表达趋势明显,6h的表达量为0h的9倍,在WGP刺激半滑舌鳎肝脏细胞后miR-200b上调表达趋势明显,2h的表达量为0的9倍。研究结果为揭示miRNA在半滑舌鳎免疫应答中的作用提供了科学依据。     

半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus)的分离与鉴定

从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevisGünther)病灶处分离出4株优势菌,经人工感染证实其中一株菌株BV1为养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌。通过Biolog系统、细菌常规形态特征和生理生化反应指标测定以及16S rRNA和gyrB序列分析对菌株BV1进行了综合鉴定,结果表明该致病菌为轮虫弧菌(Vibrio rotiferianus),其半致死量LD50为6.7×103CFU/mL。进一步的药敏试验表明其对链霉素、四环素等敏感,而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶(P450aromB)在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型P450arom的同源性较高(48.3%-66.1%),与性腺型P450arom的同源性较低(34.2%-49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1%。RT-PCR分析表明:P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

多糖调控T/B淋巴细胞免疫应答机制的研究进展

淋巴细胞是机体适应性免疫系统的重要组成,多糖对其刺激作用在生物医药领域受到广泛的关注。目前,大部分的相关研究仅限于多糖对淋巴细胞增殖及细胞因子或抗体表达水平的调控,系统的分子机制解析少见报道。综合多糖对淋巴细胞的免疫调节作用发现:活性多糖可同时刺激T/B细胞、也可选择性刺激T细胞或选择性刺激B细胞;多糖刺激T细胞免疫应答的信号通道主要为TCR/CD3→PTK→PI3-K→PKC/PLCγ→Ca2+→calcineurin→NFAT和TCR/CD3→PTK→MAPKs→AP-1;而刺激B细胞的信号通道主要包括TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB、TLR2/4→PTK→MAPKs→AP-1和IgM/CD79→PTK→MAPKs→AP-1。同时,归纳多糖刺激淋巴细胞活性的构效关系,旨在为相关领域的研究提供参考。     

半滑舌鳎病原菌(发光杆菌杀鱼亚种)的分离与鉴定

2006年夏,山东青岛某渔场养殖半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Gunther)大量死亡。症状主要表现为体表溃烂,鳍基部出血等,解剖可见胆囊发黑,肾脏发黄。从患病半滑舌鳎胆囊分离出优势菌并命名为WY06。人工感染试验证实WY06对半滑舌鳎及模式动物斑马鱼都具有很强的致病性,其半数致死量分别为5.5×103cfu/克鱼(5.2×105cfu/条鱼)和1.9×103cfu/克鱼(8.9×102cfu/条鱼)。该病原菌革兰氏染色阴性,菌体呈杆状。综合该菌在形态、生理生化特征及16S rDNA同源性等方面的结果,确认WY06为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.piscicida)。该菌对头孢呋肟、菌必治等抗生素敏感。美人鱼发光杆菌杀鱼亚种在美国、日本、欧洲的海水养殖中为常见的病原菌,但作为鱼类病原菌在中国属首次报道。     

半滑舌鳎受精卵、卵黄囊仔鱼和开口仔鱼氨基酸及脂肪酸的变化

采用气相色谱仪和氨基酸分析仪测定了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)受精卵、卵黄囊仔鱼和开口仔鱼的氨基酸与脂肪酸组成的变化。结果表明:总氨基酸组成在受精卵和卵黄囊仔鱼之间变化明显,但是在卵黄囊仔鱼和开口仔鱼之间只有细微的变化。开口仔鱼与其摄食的轮虫的总必需氨基酸组成相关。受精卵、卵黄囊仔鱼、开口仔鱼的游离氨基酸含量分别为139 mg/g、3.6 mg/g和2.5 mg/g,占总氨基酸含量的22.3%、3.6%和2.5%。饱和脂肪酸的总量从受精卵到卵黄囊仔鱼明显下降,但是发育到开口仔鱼含量无显著变化。单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的总量在不同发育阶段无显著变化,而EPA和DHA的含量从卵黄囊仔鱼到开口仔鱼有明显下降。这表明在早期发育阶段半滑舌鳎主要利用饱和脂肪酸作为能量代谢的基质,对饱和脂肪酸的利用程度大于单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。半滑舌鳎似乎需要长链的多不饱和脂肪酸如EPA、DHA和ARA。     

基于高通量测序的池塘养殖半滑舌鳎消化道菌群的结构特征分析

运用高通量测序方法研究了池塘养殖半滑舌鳎消化道和池水、池塘底泥、颗粒饵料中的微生物菌群结构,并分析了它们之间的相关性。实验结果证实,养殖池塘池水、底泥和饵料中的细菌种类多样性要远高于半滑舌鳎消化道中的细菌多样性,但消化道中的菌群结构与池水和池塘底泥中的细菌没有相关性,仅在一定程度上受到颗粒饵料中菌群的影响。而半滑舌鳎消化道不同部位的细菌种类多样性存在一定的差异,但优势菌群的组成并没有明显的结构差异,优势菌种的构成和相对数量比例非常相似,并且大部分的优势菌种在NCBI数据库中没有同源菌株。研究说明半滑舌鳎消化道菌群这一微生态系统的结构相对独立,在池塘养殖这一阶段几乎不受养殖环境中菌群的影响,而且定植肠道中的一些优势细菌种类可能具有宿主特异性。     

半滑舌鳎基因组的提取及ISSR反应体系的建立

目的:比较CTAB法和STE法提取半滑舌鳎基因组DNA的效果,通过优化半滑舌鳎ISSR-PCR反应体系,将新型分子标记简单重复间序列(Inter-simple sequence repeat,ISSR),引用到半滑舌鳎遗传多样性研究中。方法:以95%酒精固定的半滑舌鳎鳍条为材料,运用CTAB法和STE法提取基因组DNA,同时分析了模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果:CTAB法提取的基因组DNA质量好于STE法提取的结果,同时确立了稳定性强、重复性好的半滑舌鳎ISSR-PCR最佳反应体系和扩增参数。在25lμPCR反应体系中包括:1×PCR缓冲液,2mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,20ng模板DNA,1.5U Taq DNA聚合酶。反应程序为:94℃预变性5min,然后进入PCR循环,即94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,共进行40个循环。最后72℃延伸10min。结论:ISSR-PCR反应体系稳定可靠,该新型分子标记可应用于半滑舌鳎遗传多样性研究中。     

线性回归法实现半滑舌鳎幼鱼表型性状与体重的通径分析

为探讨半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)形态性状对体重的影响,实验随机选取137尾半滑舌鳎幼鱼为研究对象,测量全长、体长、体高、体厚、头长、吻端至鳃裂前缘长6个形态性状,并称量其体重.采用相关分析和通径分析的方法计算各形态性状对体重的直接和间接作用,找出主要影响因子,并建立多元回归方程.结果表明,实验所测定的各形态性状间表型相关均达到极显著水平(P0.01);各形态性状通过其它形态性状的间接作用均大于其直接作用,说明体重的主要影响因素是由多个形态性状组成的.采用逐步线性回归的方法建立了多元回归方程y=-77.901+2.404X_1+6.168X_3+33.046X_4+2.950X_5,其中Y为体重(g),X_1为体长(cm),X3为体高(cm),X_4为体厚(cm),X_5为头长(cm).经回归预测,估计值与实际观察值差异不显著,说明该方程可以简便可靠的应用于良种选育及实际生产中.     

半滑舌鳎血红蛋白α1的基因克隆及其在短期低氧胁迫下的表达分析

该文克隆了海洋鱼类——半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis,Cs)的血红蛋白α1 (CsHb-α1)基因全长cDNA序列,并研究了其在短期低氧胁迫下的表达变化.CsHb-α1 cDNA全长594 bp,编码144个氨基酸.氨基酸序列分析表明,该基因与其他物种的Hb具有较高的序列相似性.实时定量PCR检测显示CsHB-α1在心、肝、脾脏、肾脏和血液中表达量较高.与对照组相比(溶解氧:6.2 mg/L),在短期(5～120 min)及36 h低氧胁迫(溶解氧:1.0 mg/L)后,CsHb-α1在心、肝脏、脾脏、肾脏、血液和腮腺中表达量明显升高.这表明Hb-α1的上调是半滑舌鳎适应低氧胁迫的一个重要分子组成.     

HIV-1逃逸HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞应答的研究进展

特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)在控制人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染和病毒复制过程中起关键作用。HIV-1通过在CTL表位内部或侧翼发生突变逃逸HLA限制性CTL造成的免疫压力,但是部分逃逸突变是以损失病毒适应性为代价。病毒逃逸会导致相应CTL反应水平减弱,免疫系统会产生针对突变病毒株的CTL反应。HIV-1逃逸突变与宿主的CTL反应在宿主体内相互博弈。本文重点综述CTL免疫压力下HIV-1病毒发生逃逸突变的研究进展。     

外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法的优化及验证

为优化外周血T淋巴细胞亚群流式检测方法,采集小鼠肝素钠抗凝血,用FITC rat anti-mouse CD3、APC rat antimouse CD4和PE rat anti-mouse CD8a荧光抗体进行染色,裂解红细胞,通过流式细胞仪检测各亚类细胞占淋巴细胞百分比。从样本体积(50μL和100μL)、FITC rat anti-mouse CD3抗体的工作浓度(1.25～40.00μg·mL^-1)、APC rat anti-mouse CD4抗体的工作浓度(0.625～20.000μg·mL^-1)、PE rat anti-mouse CD8a抗体的工作浓度(1.25～40.00μg·mL^-1)及红细胞裂解条件(时间和裂解次数)等方面对检测方法进行了优化,并验证方法的精密度(批内差异和批间差异);同时对样品4℃放置24 h、室温放置24 h、染色处理后4℃放置24 h的稳定性进行验证。结果表明,50μL抗凝血中加入终浓度1.25μg·mL^-1FITC rat anti-mouse CD3、1...     

半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用

半滑舌鳎性别控制和全雌育种等研究领域中迫切需要一种能够快速鉴定鱼类个体遗传性别的有效方法。文章采用AFLP技术, 利用选择性引物组合(E-ACT/M-CAA)从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记。对该标记进行二次PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、克隆、测序。分析表明, 序列全长为791 bp, 与GenBank中的序列无同源性。以该雌性特异AFLP标记DNA序列为模板, 设计了一对特异的PCR引物, 成功地将其转化为SCAR(Sequence characterized amplified regions)标记, 并在100尾已知性别的半滑舌鳎个体(雌雄各50尾)中进行验证, 结果表明, 该SCAR标记在所有雌性个体中均扩增得到一条长度为324 bp的DNA条带, 而在49尾雄性个体中均扩增不到该DNA条带(有1尾雄性个体例外), 证明该SCAR标记是雌性特异的, 并可用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。随后, 利用该SCAR标记检测了3日龄半滑舌鳎幼苗, 结果表明, 雌性个体比例为41.7%。     

半滑舌鳎脑芳香化酶基因cDNA克隆及表达分析

为研究脑型芳香化酶（P450aromB）在半滑舌鳎性别分化中的作用,采用同源克隆策略,从半滑舌鳎脑分离了2184 bp长的脑型芳香化酶的全长cDNA,该基因编码498个氨基酸。氨基酸序列和系统发育分析表明,P450aromB属于脑型P450arom,P450aromB的氨基酸序列与其他鱼类脑型Ｐ450arom的同源性较高（48.3%—66.1%）,与性腺型Ｐ450arom的同源性较低(34.2%—49.9%),与自身的性腺型芳香化酶同源性为45.1％。RT-PCR分析表明：P450aromB mRNA的表达具有明显组织特异性,P450aromB只在性腺、脑、鳃和皮肤中表达,且脑中表达量远高于性腺,而在雌雄鱼的其他组织中都不表达。经过甲基睾酮浸浴处理和高温诱导半滑舌鳎由雌性性反转为雄性后,脑中P450aromB的表达量降低,这些结果表明P450aromB参与了半滑舌鳎的性腺分化和性别决定过程。     

谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫相关酶活力和低氧应激后HIF-1表达的影响

为探讨饲料中谷氨酰胺对半滑舌鳎稚鱼非特异性免疫以及低氧应激后HIF-1表达的影响, 实验共设计了4种谷氨酰胺添加量分别为0、0.5%、1.0%和2.0%的等氮等脂微颗粒饲料(游离谷氨酰胺测定值分别为0.03%、0.46%、0.91% 和1.73%), 饲喂35日龄半滑舌鳎稚鱼[平均干重(10.640.86) mg]。每天饱食投喂5次,养殖周期30d, 养殖结束后进行低氧应激实验。研究结果表明, 谷氨酰胺添加量为0.5%时半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶(LZM)活力显著高于未添加组(P0.05)。饲料中不同谷氨酰胺水平对鱼体总一氧化氮合酶(TNOS)活力和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活力没有显著影响(P0.05)。实验克隆了半滑舌鳎低氧应激关键基因缺氧诱导因子1 (HIF-1), 得到749 bp半滑舌鳎HIF-1核心序列, 系统进化树分析表明半滑舌鳎HIF-1氨基酸序列与大部分鱼类具有较高同源性。定量PCR结果显示, 饲料中谷氨酰胺水平对低氧应激后半滑舌鳎稚鱼内脏团HIF-1表达量未产生显著影响(P0.05)。综上所述, 在饲料中添加谷氨酰胺能够显著增强半滑舌鳎稚鱼鱼体溶菌酶活力(P0.05), 提高非特异性免疫水平。     

正常人外周血αβ T细胞TCR β链CDR3多态性和长度分析

采用免疫扫描谱型分析技术,分析正常人外周血T细胞TCR β链CDR3的多态性和长度分布.提取6例正常人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell PBMC）的总RNA,逆转录成cDNA,以24个TCR BV基因家族为上游引物,共同的TCR BC基因为下游引物（荧光标记）,6例样品PCR产物的基因扫描分析表明,24个TCR BV家族的CDR3谱型分析在1.5%琼脂糖凝胶电泳图上显示1个模糊条带.序列测定结果显示,各TCR BV家族的CDR3谱型均超过8个条带.GeneScan分析证明,正常人外周血T细胞的24个TCR BV家族的CDR3谱型为标准的高斯分布,各家族的CDR3表达频率相近,呈现不同的CDR3多态性和不同的CDR3长度.多数TCR BV家族产物为框架内重排（相邻2个PCR产物相差3个碱基）,少数TCR BV家族表现为两个峰群的重排.该研究对正常人TCR β链CDR3谱系的详细分析将为T细胞应答、TCR重组等研究提供基础.利用免疫谱型分析技术能监测到TCR CDR3谱型分布特征和表达频率的变化.     

日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21（Toll like receptor 21）在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21（AjTLR21）cDNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。AjTLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,AjTLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,AjTLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,AjTLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调（P < 0.05）。双荧光素酶报告基因结果显示,在AjTLR21 5'上游调控序列-1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,AjTLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明AjTLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡AjTLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。