阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性研究

目的:探讨阳离子脂质体作为基因治疗药物载体在小鼠体内的毒性。方法:采用流体动力学法,经尾静脉给小鼠注射不同剂量的阳离子脂质体,对照组注射等量5%GLU液。于注射前、注射后第1天和第3天,经眶静脉采血,用自动血球计数仪测定外周抗凝血中的白细胞(WBC)、淋巴细胞(LY%)、中性粒细胞(GR%)。用自动生化分析仪测定血浆中的清蛋白(Alb)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)。同时做脏器组织切片HE染色,观察肝、肾脏组织结构的变化。结果:与对照组比较,12μl/g剂量以上组的WBC、BUN、CR均明显升高(P<0.05),ALT、Alb无显著性差异(P>0.05)。12μl/g剂量以下组无明显变化(P均>0.05)。与注射前比较,注射后第1天,WBC、BUN、CR显著升高(P<0.05),而注射后第3天除CR外均基本恢复正常(P>0.05)。而ALT、Alb无显著性差异(P>0.05)。肝肾脏组织切片HE染色,各荆量组间组织结构变化无差异。结论:阳离子脂质体对小鼠外周血相和肾脏功能的毒性作用呈剂量和时间依赖性,故使用其作为核酸药物载体用于基因治疗研究时,剂量应小于12ul/g体重,给药时间应隔1天以上。     

阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素

阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的基因载体。简要介绍了阳离子脂质体的结构特点;着重讨论了阳离子脂质体作为基因载体时介导基因转移的机制以及在转染过程中对基因转染效率产生影响的主要因素。     

阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素

阳离子脂质体是一种非常具有发展前景的基因载体。简要介绍了阳离子脂质体的结构特点;着重讨论了阳离子脂质体作为基因载体时介导基因转移的机制以及在转染过程中对基因转染效率产生影响的主要因素。     

用于转基因的阳离子脂质体

通过直接导入外源基因来治疗人类疾病的方法需要一种有效、安全并且可重复进行的载体,阳离子脂质体是基本满足这些条件的有限几种载体中的一员. 目前已经有十几种阳离子脂质体. 这些脂质体通过外周的电荷与DNA相结合,静电吸引形成复合物在与细胞膜相互作用后,通过细胞的内吞或融合作用使复合物进入细胞内,从而将外源基因导入细胞,这种DNA传递技术的有效性和安全性已经确立. 二例利用阳离子脂质体的人体基因治疗临床试验也已开始实施,将来会有更多的临床试验得到开展,阳离子脂质体在基因治疗领域有较好的前景.     

阳离子脂质体介导基因转染肿瘤细胞

使用基因转运载体运载肿瘤细胞进行转染是基因治疗的关键环节之一。Lipo-fectamine2000和DOTAP作为商品转染试剂,具有较高的转染效率。为了进一步发掘其作为基因转运载体的应用潜力,该文研究了Lipofectamine2000和DOTAP的粒径、Zeta电位及形态,并分别与绿色荧光蛋白基因（pGFP—N2）、荧光素酶基因（pGL3）结合,形成脂质体／DNA复合物,通过载入人喉癌细胞（Hep-2）和人肺癌细胞（NCI—H460）,考察了其转染效率和细胞毒性。结果表明,脂质体Lipofectamine2000与DOTAP都能有效压缩DNA,形成复合物。Lipofectamine2000与DOTAP井目比,转染效率高,与DNA最佳转染比例范围为2：1～4：1。毒性实验显示,在N／P大于3／l时,Lipofectamine2000与DOTAP对癌细胞具有一定的细胞毒性。细胞种类对脂质体的转染效率有很大影响,Lipo—fectamine2000对Hep－2细胞的转染效率比NcI—H460高。     

用作基因传递系统的阳离子纳米载体的 细胞毒性及其机制研究进展

作为基因治疗中的非病毒基因载体,阳离子纳米载体可通过电荷作用与核酸类药物相结合,具有广阔的应用前景。然而,其细胞毒 性,主要表现为诱导细胞凋亡,限制了其临床开发与应用,也成为阳离子纳米载体研究所关注的重点。揭示和准确评价阳离子纳米载体的 细胞毒性及其机制,将有助于设计和开发更安全、更高效地用于基因传递的阳离子纳米载体。综述常用作基因传递系统的阳离子纳米载体 材料阳离子脂质体、聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸、聚苯乙烯纳米粒以及其他阳离子聚合物的细胞毒性及其机制研究进展。     

阳离子脂质体介导的基因转染大鼠BM-EPC的研究

目的:探讨阳离子脂质体法对体外分离培养的Sprague-Dawley(SD )大鼠骨髓来源-血管内皮祖细胞(Bone Marrow-Endothelial progenitorcells,BM-EPCs) 进行基因转染时脂质 体和DNA质粒安全有效的剂量组合.方法:体外分离、培养SD大鼠BM-EPCs ;免疫荧光技术测 定CD34、CD133、Dil-acLDL,对细胞进行鉴定;按照正交设计,用不同水平的脂质体和质粒 pEGFP转染细胞;荧光显微镜下计数阳性转染细胞,计算转染率.结果:SD 大鼠BM-EPCs细胞 表面抗原CD133、CD34呈阳性表达并具有吞噬Dil-acLDL的功能,形态学上两种细胞亚型-早 期及晚期外生EPCs共存于其中.Lipofectamine 2000和pEFGP不同剂量组合均可转染大鼠BM -EPCs,其中脂质体5ìl/质粒8ìg时的转染效率高于二者其它剂量组合(P＜0.05). 结论:优化条件后的阳离子脂质体Lipofectamine 2000可安全、有效转染体外分离培养的SD大鼠BM-EPCs.     

胆固醇嵌入式阳离子脂质体运载基因研究

阳离子脂质体是一种有临床应用潜力的抗肿瘤药物递药系统,助类脂能起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性类脂的细胞渗透功能。为了进一步发掘助类脂的应用潜力,该文采用胆固醇(cholesterol)作为助类脂制备阳离子脂质体,测定了脂质体的粒径及Zeta电位,脂质体的平均粒径为100~140 nm,Zeta电位为45~60 mV。脂质体分别与绿色荧光蛋白基因(pGFP-N2)、荧光素酶基因(pGL3)结合,形成脂质体/DNA复合物,通过载入人喉癌细胞(Hep-2),考察了其转染效率和细胞毒性。结果表明,阳离子类脂与胆固醇以1:1、1:2和1:4摩尔比例混合制备脂质体均能高效转染Hep-2细胞。毒性实验显示,阳离子类脂单独存在时对癌细胞具有一定的细胞毒性,随着胆固醇的加入,脂质体对细胞的毒性明显减小,与商品试剂DOTAP和Lipofectamine 2000相当。     

人肾细胞癌细胞阳离子脂质体的转染效率

以ＭＴＳ染色法测定实验剂量的Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ对细胞的毒性作用,以β－半乳糖苷酶基因为报告基因,通过Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ而转染,用Ｘ－ｇａｌ染色法,测定转染效率,结果表明实验剂量（１０μｇ／ｍｌ）的Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ对细胞生长无明显毒性。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ对多数肾细胞癌细胞的转染是有效的,且转染效率随Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ 度的增高（２．５－１０μｇ／ｍｌ）而增高,说明Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ可安     

阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究

通过改变转染试剂及DNA用量和转染时间等影响转染效率的重要因素来实现阳离子脂质体lipofectamineTM2000(lipo2000)对PC12细胞的高效转染.结果表明,lipo2000转染PC12细胞的最佳转染条件:lipo2000用量为5μL,DNA 2μg,转染时间为6 h,这种条件下的PC12细胞转染率高达40%,且未影响细胞的正常分泌,这为应用PC12细胞进行神经生物学研究提供了基础资料.     

锤头状核酶在HepG2.2.15细胞内的抗HBV特性

乙型肝炎病毒 (HBV)C基因区的 3′端序列在HBV各亚型中是高度保守的 ,它编码的多肽链都富含精氨酸 ,同时与前基因组RNA的包装和病毒DNA的复制有关。因此 ,HBV中C基因的 3′端保守区是核酶介导的抗病毒研究的理想靶位点。针对上述位点设计了锤头状核酶RzC ,同时作为对照 ,设计了相应的突变型核酶dRzC。HepG2 .2 .15细胞系是由头尾相接的HBVayw亚型基因组转染肝癌细胞系HepG2而建立的一株能稳定分泌HBV各种抗原和完整病毒颗粒的细胞系。因而用HepG2 .2 .15细胞进行核酶的抗病毒研究更接近于疾病的治疗过程。为此 ,把体外转录的核酶RzC和dRzC以及核酶表达载体pCRzC和 pCdRzC直接转染HepG2 .2 .15细胞。初步结果表明 ,体外转录的核酶RzC对HBV复制的抑制很弱 ,这可能是由于核酶在细胞内快速被RNA酶降解造成的 ;而通过内源性传递产生的核酶RzC能够明显地抑制HBV的复制。结果说明 ,锤头状核酶RzC在HepG2 .2 .15细胞内显示抗病毒感染的能力 ,有可能作为HBV基因治疗的一种手段     

HepG2.2.15细胞中联合应用siRNA抑制HBV复制和表达的研究

观察联合应用siRNA对HepG2．2．15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。应用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBVDNA水平用实时定量PCR测定;用RT—PCR检测HBVmRNA水平。结果显示,实验中应用的HBV特异性siRNA均具有明显的抗HBV抗原表达和病毒复制作用;联合应用siRNA较单独应用具有更强的抗HBV作用。可见,HepG2．2．15细胞中联合应用siRNA对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA更有效。     

香蕉皮抗氧化和抑制人肝癌HepG2细胞活性研究

对香蕉皮提取物（banana peel extraction,BPE）的体外抗氧化作用和抗肿瘤活性进行了研究。使用福林酚和硝酸铝法测定BPE中总多酚和总黄酮含量;通过检测DPPH和O₂^-自由基清除能力测定BPE的体外抗氧化活性;采用Alamar Blue法检测BPE对HepG2细胞活性的影响;荧光染色及流式技术检测HepG2细胞凋亡;免疫印迹技术检测凋亡蛋白的变化;Caspase活性检测试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9的活性;Caspase-9和Caspase-3抑制剂验证BPE抗肿瘤相关的信号转导通路。结果表明,BPE中总多酚和总黄酮含量分别为39.23 ± 2.35 mg·L^-1和26.53 ± 1.97 mg·L^-1;BPE显示出一定的DPPH和O₂^-自由基清除能力（65.31%±3.82%和51.29%±4.23%）,可明显抑制HepG2细胞的增殖（IC₅₀=54.32 mL·L^-1）;BPE通过上调Caspase-3、Bax、Bid、Apaf-1、Bak、p53、Caspase-9的表达,下调Bcl-2、Bcl-xl的表达诱导HepG2细胞凋亡;Caspase-9和Caspase-3抑制剂（Z-LEHD-FMK、Ac-DEVD-CHO）在一定程度上逆转了BPE的增殖抑制活性。BPE具有一定的自由基清除能力,对HepG2细胞具有明显增殖抑制作用,这些结果为香蕉皮的进一步开发利用提供了数据支撑。     

Lipopolysaccharide promotes adhesion and invasion of hepatoma cell lines HepG2 and HepG2.2.15

Inflammation and infection have been linked to the bionomics of many cancers, including hepatocellular carcinoma (HCC). Some bacteria, such as Helicobacter pylori, have been found in pathological specimens from patients with HCC. However, little is known about the direct effects of bacteria or their components on hepatoma cells. We analyzed the in vitro proliferation, adhesion and invasion responses of the tumor cell lines HepG2 and HepG2.2.15 to lipopolysaccharide (LPS), a cell wall constituent of Gram-negative bacteria. HepG2 and HepG2.2.15 cells show increased proliferation in response to LPS. Their invasion and adhesion abilities were also increased in response to LPS, which may be related to increased gene expression of interleukin-8 and transforming growth factor-β1. We infer that bacteria may be ignored by immune systems and directly promote adhesion and invasion of hepatoma cells through LPS.     

Structure Relationship of Cationic Lipids on Gene Transfection Mediated by Cationic Liposomes

The aim of this study was to investigate the transfection efficiency of cationic liposomes formulated with phosphatidylcholine (PC) and novel synthesized diethanolamine-based cationic lipids at a molar ratio of 5:1 in comparison with Lipofectamine™ 2000. Factors affecting transfection efficiency and cell viability, including the chemical structure of the cationic lipids, such as different amine head group (diamine and polyamine; and non-spermine and spermine) and acyl chain lengths (C14, C16, and C18) and the weight ratio of liposomes to DNA were evaluated on a human cervical carcinoma cell line (HeLa cells) using the pDNA encoding green fluorescent protein (pEGFP-C2). Characterizations of these lipoplexes in terms of size and charge measurement and agarose gel electrophoresis were performed. The results from this study revealed that almost no transfection was observed in the liposome formulations composed of cationic lipids with a non-spermine head group. In addition, the transfection efficiency of these cationic liposomes was in the following order: spermine-C14 > spermine-C16 > spermine-C18. The highest transfection efficiency was observed in the formulation of spermine-C14 liposomes at a weight ratio of 25; furthermore, this formulation was safe for use in vitro. In conclusion, cationic liposomes containing spermine head groups demonstrated promising potential as gene carriers.Key words: cationic lipids, cationic liposomes, gene transfection     

一种新型的阳离子型姜黄素纳米粒对肝细胞癌增殖的影响

姜黄药用的主要有效成分是姜黄素,曾被认为是理想的抗癌化学治疗药物之一,然而,姜黄素在水中的溶解度低,体内吸收少,生物利用度低,极大地限制了它的应用。采用乳化聚合的方法,成功地制备了粒径在250nm左右的表面带正电荷的聚氰基丙烯酸正丁酯包载的姜黄素纳米粒,该纳米姜黄素仍然保留了姜黄素本身的生物活性,可抑制人肝癌细胞株HepG2细胞的生长,阻滞细胞周期于G₂/M期,对HepG2细胞有抗增殖作用,能诱导细胞凋亡,下调在肿瘤血管生长中起重要作用的血管内皮生长因子和调控血管内皮生长因子的环氧合酶-2的表达。     

靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用.设计、合成靶向HBV S区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48 h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平.结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录.成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P＜0.01).多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同.     

Protein alteration of HepG2.2.15 cells induced by iron overload

Hepatitis B can progress into hepatocellular carcinoma. Body irons may interfere with the clearance of hepatitis B virus (HBV) and contribute to genesis of tumor. To investigate the role of iron played in HBV-related pathogenesis, here we studied the effect of iron with different concentrations and valence states on growth of HepG2.2.15 cells and secretion of virus proteins. A strong tolerance of HepG2.2.15 cells to iron challenge was found. The concentration of hepatitis B surface antigen in cell culture medium was decreased after iron stimulation. Lower concentrations of iron facilitated hepatitis B e-antigen (HBeAg) secretion. Fe(2+) appeared more effective on HBeAg secretion than Fe(3+) did. In parallel, the differential protein profiles in HepG2.2.15 cells were studied by iTRAQ and LC-MS/MS. The differentially expressed proteins were mainly involved in stress response, signal transduction, apoptosis, etc. Four proteins (14-3-3 β/α, VCP, migration inhibitory factor, and Nup153) were verified by Western-blotting and found to be consistent with the iTRAQ data. Interestingly, nuclear import of Nuclear factor kappa B (NFκB) and its activity were found to be affected by the decreased Nup153 in iron stimulated HepG2.2.15 cells. The results may indicate possible molecular mechanism how the synergism of HBV and iron stimulation damages host liver cells.     

阳离子脂质体在转基因畜禽中的应用

脂质体是由可生物降解的磷脂组成的双分子层结构,与生物膜有较大的相似性和组织相容性.阳离子脂质体作为一种新型的基因转移载体,以其生产简便、毒性低、无感染危险等优点在转基因领域越来越受到研究人员的青睐.随着转基因动物研究的不断深入,阳离子脂质体更是成为当今各种转基因方法中首选的非病毒类外源基因载体,在保护外源基因和提高其转染效率方面都发挥着重要作用.就阳离子脂质体的结构形式、介导基因转移的机制及其目前在转基因畜禽领域中的研究进展做一综述.