巢式PCR克隆猪T细胞表面抑制性受体PD-1全长基因

为了获得猪T细胞表面抑制性受体PD-1的全长基因,本研究根据猪T细胞表面抑制性受体PD-1的c DNA序列,设计合成2对引物P1/P2、P3/P4,并在P1和P2的5'端分别引入Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点。应用巢式PCR技术从感染猪瘟病毒(CSFV)石门株的猪外周血单个核细胞中,扩增获得了大小为866 bp的基因片段。将扩增的目的基因回收、纯化,克隆至p MD-18 T克隆载体,转化宿主菌DH5α。菌液PCR和质粒PCR选择可疑阳性重克隆质粒,抽提质粒,然后用Eco RⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定,最后进行基因序列测定。结果表明,成功构建猪PD-1全长基因的重组质粒(p MD-PD1)。     

真核表达猪白细胞介素17及其生物活性研究

目的:为真核表达猪白细胞介素17(IL-17),研究产物在细胞培养下的免疫生物活性。方法:通过PCR扩增出猪IL-17基因并插入到真核表达载体p VAX1,然后转染到IPEC-J2细胞、Ha Ca T细胞和L02细胞中。在转染后第24、48和72h收集细胞,第48h收集上清液。收集细胞通过实时荧光定量PCR检测相关免疫基因的表达水平,收集上清液通过抑菌试验检测相关抗菌肽的生物活性。结果:采用p VAX1载体构建了表达猪IL-17的重组质粒,转染到细胞中。证实IL-17基因能诱导抗菌肽基因(RegⅢ、S100A8和BD2)的表达,显著上调JAK-STAT信号通路基因(JAK1、STAT1和STAT3)和细胞因子基因(IL-6、IL-12和TNF-α)的表达。此外,细胞上清液能够在不同程度上抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增殖。结论:成功将猪IL-17基因真核表达,其表达产物能诱导效应细胞表达多种细胞因子,产生多种抗菌肽,具有抑菌能力;这为进一步研发猪IL-17作为抗菌免疫分子制剂奠定了初步基础。     

犬2型腺病毒E1转化细胞的建立

为建立能表达犬2型腺病毒(CAV2)E1基因的辅助细胞,本研究用含CAV2E1基因的重组质粒pcE1t对DK细胞进行转染,经G418的筛选,得到26个细胞克隆。用CAV2E1A特异引物对各细胞克隆进行PCR和RTPCR检测,PCR结果表明转染后的细胞克隆都能扩增出536bp的特异性片段,但仅有6株为RTPCR强阳性,能扩增出652bp的特异带。再对RTPCR强阳性的细胞克隆进行Westernblot分析,最终挑选到一个既能转录E1A基因,又能表达E1B19kD蛋白的克隆细胞株(DKE1)。     

荷包猪SLA-2-HB01真核表达载体的构建及在PK15细胞中的表达

为构建荷包猪SLA-2-HB01真核细胞表达载体,观察其在PK15细胞中的表达情况。首先参考SLA-2-HB01基因编码区序列设计了引物对,以SLA-2-HB01-pMD 18-T为模板PCR扩增获得SLA-2-HB01编码区基因片段,经TA克隆及菌落PCR筛选得到阳性克隆菌。测序正确后大量双酶切回收目的基因片段并与真核表达载体pEGFP N3相连接获得重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,重组质粒转化至大肠杆菌经大量克隆后,抽提阳性重组质粒并通过脂质体介导转染至PK15细胞,通过荧光显微镜观察转染后PK15细胞的荧光强度,进一步通过Western Blotting检测PK15细胞中SLA-2-HB01蛋白的表达情况。结果显示PCR成功扩增得到SLA-2-HB01,大小为1 104 bp,并成功构建重组质粒SLA-2-HB01/pEGFP N3,酶切鉴定证实插入片段大小为1 092 bp。SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒转染PK15细胞后具有绿色荧光,Western Blotting显示SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白分子量大小为70 kD,与理论值相符。成功构建了SLA-2-HB01/pEGFP N3重组质粒,并初步确认SLA-2-HB01-EGFP融合蛋白成功在PK15细胞中表达,为下一步进行SLA-2-HB01递呈多肽表位的研究奠定基础。     

梅花鹿S100A4 基因RNAi 重组慢病毒载体的构建

本研究针对东北梅花鹿S100A4 基因筛选出若干条RNAi 靶位点,并利用NCBI 中的BLAST 工具去除脱靶情况,最终得到2 条高分靶位点。然后在T4 连接酶的作用下,将其与载体质粒pLVTHM 的酶切产物进行连接,并通过PCR 鉴定及测序筛选出阳性质粒。pLVTHM 阳性重组质粒与pMD2. G 及pCMV-dr8.91 共转染到293 T 细胞中。在倒置荧光显微镜下观察转染效果并进行收获病毒质粒。结果显示在转染24 h 后,在293 T 细胞中观察到了绿色荧光。本研究成功构建出针对梅花鹿S100A4 基因的慢病毒载体,为以后进一步研究S100A4 基因在鹿茸再生中的具体功能与机制打下了基础。     

CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建猪肌抑素基因敲除细胞系

肌抑素是肌肉增生的负调控因子,为改良家畜产肉性状的重要候选基因。本研究设计了Cas9/sgRNA表达载体与供体DNA,通过电转染方法将其导入猪PK15细胞,经G418抗性筛选和荧光蛋白标记甄别,筛选到带阳性标记的细胞克隆。通过跨界PCR、长距离PCR、Western印迹、Southern印迹及PCR产物测序,证明了猪肌抑素的第3外显子序列特异性同源重组事件的发生。在猪肌抑素的第3外显子区域找到了1个有效的CRISPR/Cas9打靶位点,带阳性标记的细胞克隆经过多次筛选分离,获得了肌抑素单等位基因失活的稳定细胞系,为深入研究肌抑素的功能提供了重要的实验材料。     

GIP受体激动剂类药物筛选模型的构建

目的:GIP受体激动剂类药物筛选模型的构建。方法:GIP受体激动剂能刺激胰岛素分泌,可作为治疗Ⅱ型糖尿病的潜在药物,因此,GIP受体激动剂的筛选模型十分重要。本研究采用PCR的方法扩增GIPR基因,将扩增产物酶切回收后与表达载体pCMV6-AC-GFP连接,构建pCMV6-AC-GIPR-GFP重组质粒,转化大肠杆菌DH5α经菌落扩增、质粒提取及序列测序重组质粒;利用脂质体lipofectamine2000转染重组质粒到RIN-m5F细胞中,通过抗生素G418筛选,挑单克隆得到稳定的RIN-m5F/GIPR-GFP细胞株。结果:结果表明PCR扩增获得长度为1 319 bp的GIPR基因,克隆至pCMV6-AC-GFP真核表达载体,经菌落PCR酶切鉴定及序列分析后,证实质粒pCMV6-AC-GIPR-GFP构建成功;通过荧光显微镜观察到细胞内荧光分布均匀,表明重组质粒成功转到RINm5F细胞中。该细胞株经阳性对照(D-Ala~2)GIP处理后,与对照组对比,具有荧光斑点聚集。结论:因此,GIP受体激动剂筛选模型RIN-m5F/GIPR-GFP成功构建,可用于筛选新的GIP受体激动剂,为糖尿病药物开发提供新的筛选模型。     

A型产气荚膜梭菌α毒素全基因的分子克隆与核苷酸序列分析

应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa 1229基因)并将其克隆至pMDl8-T载体中。经转化、IPTG／X—gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI／Pstl双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实,cpa1229基因阅读开放框架由1194bp组成。经GenBank检索对照分析,cap1229基因序列与国外献报道同源性达98．3％,表明本实验所克隆的cpa1229基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-α,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α。该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107TCID50/mL。RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础。     

内江猪IL-18基因的克隆及原核表达

以ConA刺激的内江猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)为模板,采用RT-PCR技术扩增出猪IL-18全长基因,克隆其成熟蛋白的编码基因(471bp)至pMD18-T克隆载体,经双酶切和测序获得阳性克隆。通过EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切及连接反应,构建了pET-32a( )-IL-18原核表达质粒。经双酶切和DNA测序证实重组质粒构建正确,将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE,Western-blot证实表达出35kD左右的融合蛋白。经实验确定重组内江猪IL-18蛋白诱导表达的最佳条件为IPTG 0.2mmol/L,30℃诱导培养5h。在最佳表达条件下,pIL-18的相对含量为59.6%。内江猪IL-18的原核表达为重组IL-18的纯化及其生物学功能的进一步研究提供了基础。     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆与表达

目的克隆猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因,并在植物乳杆菌(Lb.plantarum)NC8中进行表达。方法通过RT-PCR方法从猪脾脏细胞中扩增出pIL-18成熟蛋白基因,克隆到T载体pMD18-T后测序;将阳性基因片段克隆至大肠埃希菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP-409构建重组表达载体pSIP-409-IL-18,进行酶切和PCR鉴定;应用电穿孔技术将其转化至Lb.plantarum NC8中,经SppIP诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果经测序,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为579 bp,编码193个核苷酸;酶切和PCR鉴定证明成功构建了重组表达载体pSIP-409-IL-18;SDS-PAGE及Western-blot分析表明重组菌表达了18 kD的融合蛋白,该重组蛋白可以与鼠抗猪IL-18多克隆抗体反应。结论成功克隆了pIL-18成熟蛋白基因,并获得有生物活性的pIL-18重组乳酸菌,为研制开发IL-18重组乳酸菌制剂奠定基础。     

猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究

本研究利用RT-PCR方法扩增猪α干扰素成熟蛋白基因后构建了重组腺病毒质粒pAd-poIFN-a,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬斑纯化后获得了重组腺病毒rAd-poIFN-α.该重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代滴度稳定,为107 TCID50/mL.RT-PCR检测证明目的基因在mRNA水平上可有效表达;在PK-15细胞上可以检测到较强的抗猪口蹄疫病毒活性,从而为研究猪口蹄疫免疫防治新技术奠定了重要基础.     

稳定表达流感病毒基质蛋白2的哺乳动物细胞系的建立

本研究构建了稳定表达甲型流感病毒基质蛋白2(M2)的哺乳动物细胞系。应用PCR方法扩增A/PR/8/34(H1N1)株流感病毒M2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)上,构建出pDF-M2重组质粒。将鉴定正确的pDF-M2与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合到宿主细胞染色体上。筛选具有Hygromycin B抗性的重组细胞株命名为CHO-M2。以间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测M2的表达,共获得15株高表达M2蛋白的重组细胞株。这些重组细胞株在连续培养10代后,PCR方法仍可检测到M2基因的存在,IFA也检测到蛋白的稳定表达。本研究成功获得了稳定表达甲型流感病毒M2的哺乳动物细胞系,为M2蛋白的功能研究和非复制型流感病毒疫苗的研制提供了新的工具。     

猪β2-AR基因重组质粒的快速筛选

为建立一种高效快速鉴定重组质粒的实验方法,将猪β2-肾上腺素能受体（β2-AR）基因与pET-32C重组,构建β2-AR基因表达载体pET32CAR,以T7启动子引物和猪β2-肾上腺素能受体基因特异性引物为PCR引物,挑取重组质粒转化单菌落直接进行PCR,产物经电泳发现,5个候选克隆中有3个克隆扩增出了一条约2kb的特异性条带,并且插入方向正确,随机选取其中1个克隆用限制性酶切鉴定以及DNA测序验证PCR筛选的正确性,研究结果表明;在采用PCR方法对重组克隆进行鉴定时,可以直接使用细菌菌落参与反应,而无须提取克隆的DNA,与传统的实验方法相比,筛选的时间缩短至3-4h,大大提高了重组DNA的筛选效率。     

人CXCL9重组腺病毒的制备及其表达产物生物活性检测

目的构建携带人CXCL9基因的重组腺病毒,分析其表达产物的生物学活性。方法采用PCR法从pBLAST2-hCXCL9质粒上扩增出hCXCL9基因,再将其克隆至pENTR11载体上,构建pENTR11-hCXCL9质粒,通过同源重组将hCXCL9基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后在293A细胞内进行包装、扩增后得到携带hCX-CL9基因的重组腺病毒。用包装好的病毒感染Hela细胞,分析目的基因的表达及其生物学活性。结果成功地将hCXCL9基因片段克隆至重组腺病毒载体上,并经293A细胞包装出病毒颗粒。该病毒感染Hela细胞后,可在培养上清液中检测到显著表达的hCXCL9。通过趋化活性分析发现,该表达产物对T淋巴细胞具有明显的趋化活性。结论成功构建了hCXCL9重组腺病毒,并可在体外高效表达具有生物活性的目的产物。     

博尔纳病病毒X基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)X蛋白真核表达载体,为BDV X蛋白的功能研究奠定基础。方法从BDV持续感染的人少突胶质瘤细胞(oligodentrocyte,OL)的总RNA中,通过逆转录和PCR获得BDV X基因的完整序列,将其连接到pc DNA6-myc-His(A)载体上,转化至E.coli感受态细菌后,提取质粒筛选阳性克隆,通过PCR法和DNA测序进行鉴定,并转染至OL细胞,通过Western blot方法验证重组蛋白的表达。结果测序鉴定目的基因序列正确插入至pc DNA6-myc-His(A)载体的酶切位点,PCR扩增的基因片段大小与目的基因相同,Western blot证明转染至OL细胞后可表达BDV X-His融合蛋白。结论成功构建了博尔纳病病毒X基因真核表达载体pc DNA6-myc-His(A)-BDV X。     

含G0S2基因启动子的荧光素酶报告基因载体的构建

目的:克隆人G0S2基因启动子并构建荧光素酶报告基因载体,为进一步研究G0S2基因转录调控提供质粒。方法:利用PCR技术从人胚肾293A细胞基因组DNA中克隆获得G0S2基因启动子的DNA片段,将其克隆至pGL3-basic表达载体中,并转化人大肠杆菌DH5α,经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将重组载体质粒与半乳糖苷酶表达质粒psV-β-Galactosidase共转染至大鼠血管平滑肌细胞(VSMC),检测细胞中荧光素酶的活性。结果:pGL3-G0S2-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的G0S2基因片段有启动子活性(P0.05)。结论:成功构建了pGL3-G0S2-Promoter报告基因质粒,为进一步研究G0S2基因的表达奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒HA基因在昆虫细胞中的截短表达

目的:利用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表达重组HA蛋白,Western blot及IFA方法鉴定其表达。方法:采用PCR方法扩增A/California/04/2009(H1N1)HA基因,将其克隆到pFastBacHT A载体上,重组质粒pFastBacHT-HA经双酶切及测序鉴定正确后,转化阳性重组载体进入E.coli DH10Bac感受态细胞中,通过Bluo-gal蓝白斑筛选、PCR鉴定获得重组转座子rBacmid-HA。从重组转座子中提取rBacmid-HA质粒DNA转染sf 9昆虫细胞,制备重组杆状病毒。重组杆状病毒感染sf 9细胞表达重组蛋白,Western blot及IFA鉴定重组蛋白表达情况。结论:成功构建了甲型H1N1流感病毒HA基因的昆虫杆状病毒表达载体,该表达载体转染昆虫细胞后制备的重组杆状病毒病毒滴度较高,重组杆状病毒表达的重组蛋白经Western blot 及IFA 鉴定后具有良好的免疫反应原性。     

单菌落PCR法直接快速鉴定重组克隆

利用单菌落PCR法直接筛选含有GFP、LTB-ST外源基因的重组克隆,阳性克隆可以扩增出目的条带,和质粒PCR扩增的结果一致。同时,单菌落PCR法也可应用于重组质粒转化后的农杆菌的筛选,单菌落PCR法的扩增结果和农杆菌液扩增的结果一致。结果表明,单菌落PCR法是一个有效简便的鉴定重组阳性克隆的方法。