基于RAST的离子束重组菌DOB981的代谢网络研究

为进一步深入理解低能离子注入对DOB的生理代谢产生的生物学意义,本研究基于DOB全基因组De novo测序数据,应用生物信息学方法对离子束重组菌DOB981及其原始菌株进行基因组结构和功能注释,构建基因尺度的代谢网络,并用Cytoscape对其进行可视化分析。研究表明,离子束重组菌株DOB981的基因组大小比原始菌株减少了223 268 bp,ORF减少了204个,功能基因减少了136个,生化反应的数量减少了10个,而生物反应的反应底物比原始菌株增加了3个;离子束重组菌株DOB981独有19个生化反应,比原始菌株减少了10个。Cytoscape可视化分析表明,离子束重组菌DOB981代谢网络中包含1 604个节点和3 733条连线,虽然比原始菌株减少了1个节点,但连线却增加了68条。基因尺度代谢网络拓扑属性分析表明,离子束重组菌DOB981与原始菌株的代谢网络均为无标度网络,具有小世界网络(SWN)特性,但重组菌DOB981的代谢网络的特征路径长度大于原始菌株,其总体结构相对松散,且密度低。本研究不仅对DOB的环境适应性机制的研究具有重要意义,也为DOB基因组代谢网络模拟构建提供了理论基础。     

基于基因组De novo测序的离子束重组沙漠寡营养细菌的16S rRNA基因研究

为了进一步理解低能N+注入在沙漠寡营养细菌(DOB)系统发育与进化中的作用,本研究基于DOB基因组De novo测序数据,应用生物信息学方法对3株离子束重组菌株DOB073、DOB113和DOB981的16S r RNA基因的突变与进化进行了分析。分析表明,3株离子束重组DOB的16S r RNA基因拷贝数均比原始菌株增加了5个,并分别在C1区、V1区、V2区、V4区、V6区、V7区和V9区发生了碱基突变。进化分析显示DOB981的进化速度快于DOB073和DOB113。16S r RNA的保守二级结构预测表明,9个保守二级结构所处碱基位置分别为:80~120、120~240、240~360、360~480、400~520、640~760、760~880、800~920和1 420~1 540。本研究为低能离子注入介导的原核微生物进化提供了直接的分子证据。     

低能N~+注入介导的沙漠寡营养细菌基因组SNP研究

为了深入认识低能N~+注入对细菌基因组的进化与突变的作用,本研究在低能N~+注入介导外源基因转化沙漠寡营养细菌DOB150的基础上,通过生物信息学方法对3株重组突变的DOB基因组的单核苷酸多态性进行了分析,共发现192 357个SNP位点。其中重组突变菌株DOB073和DOB113的SNPs类型和数量基本相等,而重组突变菌株DOB981的SNPs类型丰富且数量大。DOB073和DOB113基因组中SNP数目约为0.005个/kb,DOB981约为37.620个/kb。在3株重组突变菌的基因组的SNPs中,AG转换所占比例均为最高。根据SNPs绘制的DOB基因组系统发育树显示,重组突变菌株DOB981的进化速度快于DOB073和DOB113。     

低能N~+注入介导的沙漠寡营养细菌的nifH基因突变研究

在低能N+注入沙漠寡营养细菌DOB150菌株获得重组突变菌株DOB981的基础上,本研究应用生物信息学方法从DOB全基因组De novo数据中获得了nif H基因信息,分析结果表明重组突变菌株DOB981的2个拷贝nif H基因中分别有39个和5个碱基位点发生了突变。通过分析nifH基因的蛋白质二级结构,获得了蛋白质的结构域、功能位点、跨膜区域和卷曲螺旋等基本信息,为进一步理解低能离子注入介导的功能基因突变提供了分子证据。     

基于转录组学分析大肠杆菌中purR基因缺失对胞苷合成代谢的影响

胞苷可作为功能营养化学品与药物合成原料,具有重要的应用价值。大肠杆菌中由purR基因编码的DNA结合转录抑制因子对胞苷合成代谢有重要调控作用。采用CRISPR/Cas9技术敲除大肠杆菌purR基因,并通过转录组学分析突变菌株基因表达的差异。结果表明,从出发菌株E.coli NXBG-12基因组上成功敲除了purR基因,获得了突变菌株E.coli NXBG-17P。对突变菌株E.coli NXBG-17P与E.coli NXBG-12的转录组学结果进行对比分析,发现有534个差异基因,其中上调基因302个、下调基因232个;GO分析显示,差异表达基因(DEGs)主要富集于细胞膜、ATP结合、DNA结合和水解酶活性的代谢过程;KEGG分析表明,上调基因主要富集在果糖和甘露糖代谢、嘧啶代谢和磷酸转移酶系统,下调基因主要富集在氧化磷酸化、半乳糖代谢和肽聚糖的生物合成。同时,突变菌株E.coli NXBG-17P在37℃摇瓶发酵40 h,测定胞苷浓度为(3.21±0.01) g/L,是出发菌株E.coli NXBG-12的1.58倍。这表明突变菌株E.coli NXBG-17P胞苷产量升高,可能...     

氟氏链霉菌离子束注入突变谱的分析

用低能N⁺离子束注入转谷氨酰胺酶产生菌氟氏链霉菌后,通过试验,初步确定了注入的效应曲线,获得了一系列突变菌株。提取原始菌株和突变菌株的DNA,采用PCR反应分段扩增出转谷氨酰胺酶基因进行单链构象多态性分析(SSCP),并将特异性条带克隆测序进行基因突变型的鉴定,分析离子束注入引起链霉菌基因的基因突变类型及特点。结果显示:碱基变异的类型包括转换、颠换和缺失。在检测到的24个碱基突变中,主要是碱基的置换(87.5%),碱基缺失的比例比较小(12.5%)。在碱基置换中,转换的频率(58.3%)高于颠换的频率(29.2%)。转换主要以C→T,A→G为主,颠换以G→T,C→G为主。此外构成DNA的4种碱基均可以被离子束辐照诱发变异,其中胞嘧啶发生突变的频率较高。     

rimJ基因缺失不影响大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性

目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大比生长速率,利用统计学方法分析rimJ基因的缺失对BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性是否有影响。结果:rimJ基因被成功敲除;统计分析结果表明缺失突变株和原始菌株的最大比生长速率没有明显区别。结论:rimJ基因缺失对大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性无影响。     

草菇耐低温突变菌株Vtlt-1和原始菌株V23转录组差异的研究

为了培育草菇耐低温菌株与解析其耐低温的分子机制,采用紫外诱变的方法,选育出耐低温草菇菌株Vtlt-1,并利用表达谱芯片技术,比较突变菌株Vtlt-1与原始菌株V23的表达差异基因,筛选差异显著基因后利用GO（gene ontology）功能注释和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集等方法分析,结果发现与V23相比Vtlt-1表达显著差异基因共有1 600个,其中704个基因上调表达,896个基因下调表达。针对差异基因的GO功能分类结果发现：生物学过程方面,差异基因主要分布在金属离子结合、氧化还原过程、碳水化合物的代谢与核酸的结合。细胞组分方面主要与细胞核相关;分子功能中,氧化还原活性以及解旋酶活性,依赖于ATP 的解旋酶活性、DNA指导的RNA聚合酶活性。KEGG注释结果发现差异表达基因主要富集在氨基酸与氮类物质的代谢、脂肪酸与生物碱的合成这两方面,此外还富集到核糖体的生物合成、细胞色素P450、RNA聚合酶、硫和氨基酸的代谢、核酸的修复等通路。这些结果为解析草菇耐低温机制提供分子依据和理论基础。     

低能离子束生物技术的应用

自从我国科学家发现离子注入生物学效应后,低能离子束生物技术的研究就在我国率先兴起。随后,越来越多的科学家基于低能离子与生物体之间存在的能量沉积、动量传递、质量沉积及电荷中和与交换的相互作用,对生物体内的遗传物质进行加工、修饰、重组,开辟了农作物和微生物等遗传改良及转基因的新方法。本文简要介绍了低能离子束生物技术产生的背景、低能离子束与生物体之间相互作用的机理和特点以及目前低能离子束在诱变育种和转基因等生物技术领域的研究进展,并展望了离子束技术在藻类基因工程方面的发展潜力。     

离子束重组酵母菌Ar_Han0458的RAPD与SSH的初步研究

通过低能氩离子注入介导蓝麻黄基因组DNA转化异常汉逊酵母菌,获得了遗传稳定的产麻黄碱的重组酵母菌株Ar_Han0458。RAPD分子检测结果表明重组菌株和出发菌株基因组之间存在多态性变化,从重组菌株DNA中分离得到一个439 bp的差异条带。经PCR验证,其5'端150 bp片段来源于麻黄基因组。通过SSH实验,从重组菌株DNA中分离获得9条差异基因表达片段,BLAST同源比对分析,其中5条差异表达基因片段功能分别为:乙醇脱氢酶、二氢鞘氨醇羟化酶、分子伴侣蛋白、亚精铵转运蛋白和NAD依赖的差向异构酶/脱水酶,另外4条差异表达基因在数据库中无同源序列。     

利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌asa A基因

目的利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌ATCC 17978的asaA。方法设计上下游引物中包含asaA的同源序列,并以pKD4质粒为模板,扩增含有卡那霉素抗性基因的DNA片段。将该片段转化于表达重组酶的17978感受态细胞中,在卡那霉素筛选压力下,得到经两次同源双交换的具有卡那霉素基因标记的突变菌株。随后,在重组酶的作用下将抗性基因去除,最终得到无抗性基因标记的突变菌株ΔasaA。结果通过该重组系统,首先将卡那霉素抗性基因的DNA片段替换了基因组中asaA的DNA片段,然后将卡那霉素抗性基因的DNA片段消除,最终获得了asaA缺失的突变体。结论通过Red重组系统为鲍曼不动杆菌中其他基因的缺失突变提供方法与思路。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

低能离子束促进小麦copia-反转录转座子的转录与转座

LTR-反转录转座子是真核基因组重要的组成部分,能通过RNA中间体完成在基因组上的转座。小麦种子受低能氮离子束注入后能促进其反转录转座子的转录,经不同剂量的氮离子束注入的种子发芽24h和48h后,其中的copia-反转录转座子的转录都有不同程度的提高,最高可达到对照的40倍。用基于反转录转座子扩增多态性和反转录转座子微卫星扩增多态性2种分子标记技术扩增经低能氮离子注入后的小麦DNA,指纹图谱显示出了一定的多态性,这说明低能氮离子束激活了小麦中反转录转座子的转座活性。转座子转录活性的增强可调节其邻近基因的表达和mRNA的拼接,反转录转座子插入到基因组上新的位点后,使基因组上的基因发生了重排,这种重排可能表现为植物表型的改变。因此,推测反转录转座子的转录活性提高和转座激活是产生低能离子束注入生物效应的重要原因之一。     

氮离子诱变筛选内切葡聚糖酶高产菌株及其基因突变研究

目的：离子注入枯草芽孢杆菌筛选高产内切葡聚糖酶突变菌株,同时进行其酶活性研究,并克隆该基因,研究离子注入对其诱变效应。方法：低能氮离子重复注入枯草芽孢杆菌,筛选获得1株高产内切葡聚糖酶突变菌株Bac11。DNS法测定酶活性。PCR扩增获得出发菌株Bac01和突变菌株Bac11内切葡聚糖酶基因,并对核酸序列及预测氨基酸序列进行多重比对。结果：突变菌株Bac11内切葡聚糖酶活性从93.33IU提高到381.89IU。多重比对Bac01和Bac11内切葡聚糖酶基因编码区1500bp序列,当中有10个碱基发生突变,预测氨基酸序列中有5个氨基酸残基发生变化,且都在其基因纤维素结合域部分。结论：低能氮离子重复注入对枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶活性及其基因有明显的诱变累加效应。     

致病性大肠杆菌UPEC CFT073全基因组分析及致病机制的新认识

尿道致病性大肠杆菌UPEC CFT073菌株(uropathogenic Escherichia coli CFT073)于2002年被完全测序并注释。但是,对其基因组的研究还很不完善,首先表现在基因组注释的系统性错误和滞后性。作者运用一系列生物信息学方法和工具,从编码蛋白质基因、编码RNA基因等角度对RefSeq数据库的基因组注释进行了系统的修正和增补,并在此基础上鉴别了一批新的候选致病因子基因。进一步的分析表明,得到的基因组注释对CFT073致病相关的一些重要调控关系和机制能够给出更准确、完整的描述。     

金黄色葡萄球菌hmp基因缺失突变株的构建及抗一氧化氮能力分析

摘要：【目的】:构建金黄色葡萄球菌RN6390黄素血红蛋白(flavohaemoglobin, HMP)基因缺失突变株,研究其抗一氧化氮(Nitric Oxide, NO) 能力及其在细菌生物被膜形成中的作用。【方法】：根据同源重组技术的原理,利用PCR扩增RN6390的hmp基因上下游同源臂,经过抗生素和温度交替培养筛选hmp基因缺失突变株,利用基因组PCR、定量PCR对突变菌株进行鉴定。以硝普钠（SNP）为NO供体,检测了hmp基因缺失菌株的抗NO能力,并初步研究了hmp基因在生物被膜形成中的作用。【结果】：成功构建了RN6390的hmp基因缺失突变株,外源NO能够诱导菌株hmp基因的表达,hmp基因缺失菌株抗NO能力明显下降,但其生物被膜形成能力有明显提高。【结论】：获得了RN6390的hmp基因缺失突变株,该突变株的获得为进一步研究hmp基因的生物功能,以及细菌内源性NO的作用奠定了良好的技术平台。     

离子束重组酵母菌N6076的基因表达与蛋白质组学初步研究

利用低能氮离子注入介导外源DNA转化酵母菌,获得了遗传稳定的产醌类物质的重组酵母菌株N6076。利用抑制差减杂交(SSH)技术从重组菌N6076的DNA中分离获得了14个差异表达基因片断,其中由于碱基突变造成其蛋白质氨基酸序列变化的差异表达基因有4个。这些差异表达基因的功能分别涉及遗传信息的转录和翻译。应用2-D荧光差异双向电泳-质谱(2-D DIGE-MS)技术,在重组菌N6076中共检测到56个蛋白质表达量变化的差异点(p0.05),其中26个蛋白质表达量上调,编号为273和1 294的蛋白质可信度指数分别为81.37%和12.86%。本研究为离子束重组酵母菌生物合成醌类物质的代谢通路研究提供了一定的帮助。     

不同种型布鲁菌间的基因获得与缺失研究

目的:了解不同种型布鲁菌间的基因差异及基因的获得与缺失情况。方法:采用生物信息学方法比较分析已测序的10株布鲁菌基因水平的差异,分析它们的核心基因组与泛基因组,对得到的差异基因用PCR验证其在19株不同生物型标准菌株中的分布情况。结果:不同种型布鲁菌在基因水平上存在较大差异,差异基因主要位于Ⅱ号染色体上;根据差异基因,鉴定了42个差异区段,这些差异区段在19株不同生物型标准菌株中存在差异分布。结论:布鲁菌在进化过程中分别获得或失去了不同的基因区段,从而适应不同的宿主环境。     

苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株的特点

摘要：【目的】构建苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株,并研究其与出发菌株的表型及性质差异。【方法】采用基因同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中的spoIIID基因,构建了spoIIID缺失突变株,测定生长曲线,并通过扫描电子显微镜观察,芽胞计数分析及SDS-PAGE 蛋白电泳比较突变株与出发菌株的差异。构建遗传互补菌株,观察菌株性状的回复情况。【结果】通过温敏载体同源重组敲除技术获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株spoIIID基因缺失突变株,生长曲线测定表明,突变株较出发菌株在平稳期后期生长较缓和;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体。SDS-PAGE结果显示,在 SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低。利用载体pHT315携带spoIIID操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力。【结论】本研究证明spoIIID基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关。     

黑曲霉htmA基因的分离鉴定及其功能分析

本研究通过分析比较黑曲霉基因组与人、哺乳动物和酿酒酵母基因组序列同源性,首次分离鉴定了黑曲霉htmA基因,该基因长3459bp,编码1083个氨基酸。已知真核生物的htmA基因编码一种类α-甘露糖苷酶I的非必须蛋白HTMA,在内质网中参与降解非正确折叠的糖蛋白,htmA基因的破坏会延迟非正确折叠糖蛋白的降解。为分析htmA基因在黑曲霉中的功能,运用同源重组技术敲除黑曲霉基因组中的htmA基因,获得htmA基因缺失突变菌株,并进行了缺失株外源漆酶分泌能力的检测。结果表明黑曲霉htmA基因的破坏延缓了外源漆酶的降解,由此推测黑曲霉htmA基因编码蛋白HTMA具有与酵母、哺乳动物HTM1P/EDEM类似的功能作用。