大肠杆菌yigP基因转录调控序列的鉴定

【目的】调查yigP基因启动子的活性,并对该转录调控序列进行分析。【方法】以lacZ为报告基因,克隆启动子片段至启动子探针质粒中,通过检测β-半乳糖苷酶活性判断启动子活性,并通过克隆一系列逐步缩短的启动子片段来确定启动子所在区域。利用定点突变技术,对启动子的重要序列进行定点突变,调查其对启动子活性的影响。【结果】确定了yigP基因启动子的区域,鉴定了启动子的-10区和-35区,并发现了启动子上游存在一个负调控序列,对该序列进行了初步的研究显示其中部分序列是这种负调控作用的核心序列。【结论】对yigP基因的转录调控序列进行了鉴定,丰富了我们对基因转录调控的认识。     

46,XY女性性反转患者SRY基因启动子区一个新的点突变及其功能分析

通过ＤＮＡ序列测定在一名４６,ＸＹ女性反转患ＳＲＹ基因启动子区发现了一个新的突变：ｎｔ－８１Ｇ－Ａ。该突变不见于正常男性,因此不是ＤＮＡ多态性。为了检测这一点突变对ＳＲＹ基因表达功能的影响,构建了分别由正常或突变的人ＳＲＹ基因启动子区片段调控氯霉素乙酰转移酶报告基因表达的两个质粒,寡核苷酸探针杂交证实该启动子片段正常或携带有Ｇ－Ａ突变。     

β－内酰胺酶启动子C－17缺失对其强度的影响

通过酶学手段在β－内酰胺酶启动子间隔序列中造成Ｃ－１７的缺失突变,以氨苄青霉素为底物,检测突变前后β－内酰胺酶活力变化,并作了细菌的Ａｍｐ耐受性试验,实验结果表明,Ｃ－１７的缺失突变使启动子强度增加约６０％,含有突变启动子的细菌对Ａｍｐ的抗性明显增强,突变体生长的半抑制浓度为２８０μｇ／ｍｌ,而在此浓度下野生型菌体吸光度只有突变体的５０％左右,对启动子强度增加的原因进行了讨论。     

β－内酰胺酶启动子C－17缺失对其强度的影响

通过酶学手段在β-内酰胺酶启动子间隔序列中造成C-17的缺失突变.以氨苄青霉素(Amp)为底物,检测突变前后β-内酰胺酶活力变化,并作了细菌的Amp耐受性试验,实验结果表明,C-17的缺失突变使启动子强度增加约60%,含有突变启动子的细菌对Amp的抗性明显增强.突变体生长的半抑制浓度为280μg/ml,而在此浓度下野生型菌体吸光度只有突变体的50%左右,对启动子强度增加的原因进行了讨论.     

基于移动序列模式分析人基因组调控短序列

基因表达过程主要包括转录、剪接和翻译,多种调控元件参与其中,是个高度调控的过程。建模识别分析这些调控元件,对理解基因表达具有重要意义。本研究提出了一个基于移动序列模式的短序列建模模型,并对转录启动子和剪接调控元件进行了建模分析。启动子是基因转录的核心调控元件,剪接调控元件参与调控剪接位点的识别。分类实验结果表明,该模型可有效识别转录启动子序列和剪接调控元件序列。并进一步利用该模型,建模分析已为生物实验验证的、会导致剪接影响的基因组变异,实验结果表明,该模型可有效预测基因组变异的剪接影响,进一步验证了该模型的有效性。     

一步法定点突变技术快速构建bsh基因突变启动子

目的：建立一种高效便捷的定点突变方法,为基因表达调控以及蛋白质结构和功能的研究提供技术支撑。方法：以构建单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）中编码胆碱水解酶（bile salt hydrolase,BSH）的bsh基因突变启动子为例,采用一对完全互补并带有突变位点的引物扩增携带bsh基因启动子的重组质粒DNA全序列,通过DpnⅠ消化PCR产物中剩余的甲基化的模板DNA,酶切后的PCR产物直接转化大肠杆菌,从而获得含有突变启动子的重组质粒。结果：通过一步法定点突变技术成功构建了bsh基因的三种突变启动子。结论：该方法简单高效,只要把握好对引物设计,高保真的DNA聚合酶、模板DNA的浓度以及PCR扩增程序的选择,突变成功率可以达到100%。     

毕赤酵母醇氧化酶2启动子上游调控序列的随机突变研究

巴斯德毕赤酵母是表达外源蛋白的重要宿主之一.醇氧化酶2启动子(PAOX2)与醇氧化酶1启动子(PAOX1)的启动模式相同,但是启动强度不同.为了研究其醇氧化酶启动子PAOX2的上游调控序列,本文利用随机突变的方法对醇氧化酶启动子PAOX2的上游调控序列进行了随机突变,构建了PAOX2上游调控序列突变文库,检测突变体启动...     

利用定点突变分析白念珠菌依赖铁基因FRP1启动子元件

通过对白念珠菌高铁还原酶基因FRP1启动子进行突变分析, 确认启动子中特殊调控元件。我们通过分析FRP1起始密码子上游1000 bp序列发现在-160 和-650处有2个推测的Rim101p结合位点, 对其分别进行定点突变, 然后构建启动子与报告基因LacZ融合质粒, 转化整合到白念珠菌rim101-/-株和野生株中, 检测不同缺铁条件下b-半乳糖苷酶活性。结果发现碱性条件, Rim101p能够正向调控FRP1的表达; 启动子-160处突变对启动子功能影响较弱, 而-650突变使启动子活性大大降低, 此结果和双突变的结果相同, 表明Rim101p主要通过与启动子-650处结合位点相互作用来调控FRP1的表达。     

依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒,使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明:位于inlC启动子转录起始点下游22bp处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的”PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。     

家蚕核多角体病毒解旋酶基因启动子及增强子hr3功能分析

从BmNPVZJ8株克隆了解旋酶（helicase)基因ATG上游的510bp启动子,序列分析发现,该启动子同时具有早期和晚期RNA转录起始位点,将起始密码突变为ATT后,引入萤火虫荧光素酶（Luc)基因作瞬时表达分析,用表达质粒pBmhel510luc转染Bm-5和Sf-21细胞,解旋酶基因启动子能被细胞的RNA聚合酶识别,具有早期启动子的特性,且病毒因子对hel510启动子具有反式激活作用。杆状病毒同源重复区（hr)序列是病毒DNA复制起始点,又具有增强子功能,将BmNPVhr3序列克隆到hel510启动子的下游进行瞬时表达,结果表明,hr3可增强hel510启动子在昆虫细胞和家蚕幼虫中的转录活性分别在7000倍和1000倍左右。     

结核分枝杆菌H37有毒株与无毒株的代谢相关基因pabB和lpdA启动子活性分析

【目的】通过分析结核分枝杆菌无毒株H37Ra的全基因组序列,并与H37Rv基因组序列比较,发现pabB和lpdA预测的启动子区发生了突变。我们利用报告基因,确认启动子突变与其基因转录水平的关系,探索结核分枝杆菌H37Ra毒力丧失的内在原因。【方法】利用生物信息学方法预测这两对基因的启动子区,采用PCR技术克隆这两对基因的启动子,与分枝杆菌启动子探针载体pMC210相连,DNA测序证实连接片段正确后,用电穿孔法将重组质粒转化至耻垢分枝杆菌mc2155。利用Quantitative Real-Time RT-PCR检测报告基因lacZ转录水平的差异,进一步验证这两对基因启动子的突变对相应基因转录水平的影响。【结果】Quantitative Real Time PCR检测结果显示H37RapabB启动子活性是H37Rv pabB启动子活性的6倍(p0.05),而H37Rv lpdA启动子的活性是H37RalpdA启动子的2倍(p0.05)。【结论】pabB,lpdA的启动子在H37Ra中的突变对其启动子的活性产生了影响,其中lpdA启动子的突变可能与结核分枝杆菌H37Ra的毒力丧失有关。     

46,XY女性性反转患者SRY基因启动子区一个新的点突变及其功能分析

通过ＤＮＡ序列测定在一名４６,ＸＹ女性性反转患者ＳＲＹ基因启动子区发现了一个新的突变：ｎｔ．－８１Ｇ→Ａ．该突变不见于正常男性,因此不是ＤＮＡ多态性．为了检测这一点突变对ＳＲＹ基因表达功能的影响,构建了分别由正常或突变的人ＳＲＹ基因启动子区片段调控氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）报告基因表达的两个质粒,寡核苷酸探针杂交证实该启动子片段正常或携带有Ｇ→Ａ突变．这两个质粒分别与ｐＳＶ－β－半乳糖苷酶内对照质粒共转染ＨｅＬａ细胞后,瞬间表达分析显示这一突变对ＣＡＴ酶活性水平无显著影响（０．５０＞Ｐ＞０．２０）．上述正常和突变的ＳＲＹ基因启动子片段与Ｋ５６２细胞核抽提物的凝胶阻滞实验也表明,突变对Ｋ５６２细胞核蛋白与ＳＲＹ基因启动子区的结合影响不大．研究ＳＲＹ基因的表达调控对阐明人的性别决定机制及性反转的病理机制具有重要意义     

依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。     

苏云金芽胞杆菌aiiA的5'端侧翼序列的克隆与功能鉴定

为了研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)N-酰基高丝氨酸内酯酶(N-acylhomoserine Lactonase,AiiA蛋白)表达调控机制,确定aiiA的启动子区域。本研究克隆了aiiA的5'端侧翼区(aP-1930--1),以gfp作为报告基因,分段克隆aiiA的5'侧翼区,鉴定启动子活性,并对aiiA启动子序列中的碱基对-150和-142之间的2个连续的TATA盒进行定点突变。结果显示,侧翼序列aP-295--101和aP-295--1可作为启动子,实现GFP在大肠杆菌中的异源表达,启动子序列aP-295--101比aP-295--1活性更强,aP-101--1序列不能启动GFP表达。定点突变pET28a-aP-295--101-gfp载体2个TATA盒显著降低GFP表达。表明-295--1bp为aiiA的启动子区,-429--296与-100--1序列是aiiA的负调控序列。-150--142 bp区域的2个TATA盒对aiiA的5'侧翼区域的启动子活性起关键的作用。     

puc启动子上游DNA二元对称序列突变对Rhodobactersphaeroides…

为了鉴定ｐｕｃＢＡ基因表达受氧调控的顺式调节位点,通过ＰＣＲ和多了聚核苷酸定点突变的体外操作,在ｐｕｃ转录子５’上游非编码区产生了７个不同突变和５个不同１０ｂｐ缺失序列。构建了含有各种顺序突变的ｐｕｃ上游区,ｐｕｃ启动子和报告基因ｌａｃＺ的转录融合子。通过融合子β－半乳糖苷酶活性分析,发现位于ｐｕｃ启动子上游二元对称结构的突变使用ｐｕｃ启动子上游二元对称结构的突变使得ｐｕｃ基因在有氧条件下去阻遏表     

cⅠ857基因的体外定位同义突变

 ｃⅠ８５７基因的体外定位同义突变陈南春,高辉,陈苏民,杨萍,刘新平（西安第四军医大学分子生物学研究所,西安７１００３２）外源基因要在大肠杆菌中获得高表达,需要合适的ＳＤ序列和可调控的强启动子［１］。ＰＬ启动子在原核启动子中属强启动子,它受ｃⅠ基因产物...     

玉米AGPase基因启动子的克隆及鉴定

以玉米基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增得到了腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶AGPase基因编码区上游1912 bp的启动子(AGPasep)序列.该序列包含TATA-box,CAAT-box等一些高等植物特有的启动子基本核心序列,推断其为一种新的启动子.为了验证该序列是否具有启动子功能,构建了含有此序列的植物表达载体pCAM-AGPasep,通过农杆菌介导法转化玉米愈伤组织进行瞬时表达.GUS染色结果表明,该序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子功能.     

FLT-1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建和鉴定

目的：为探索FLT-1启动子靶向调控活性分析,克隆FLT-1启动子基因序列,构建并鉴定肿-1启动子调控的荧光素酶报告基因重组体pGL3-FLT—Basic—luc。方法：应用聚合酶链式反应（PCR）技术扩增FLT-1启动子序列,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic—luc中,构建含有正确目的基因的报告基因重组体pGL3-FIT—Basic—luc,通过限性内切酶酶切、PCR及测序进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及基因测定证明,所克隆的基因产物与预期结果-致,序列无碱基突变。结论：成功构建了含有FLT-1启动子基因序列的荧光素酶报告基因真核表达载体,为下-步分析该启动子活性及血管疾病的基因治疗奠定基础。     

启动子工程改造大肠杆菌K4生产果糖软骨素

为了进一步提高大肠杆菌K4发酵生产果糖软骨素(K4CPS)的产量,将合成基因簇region 3启动子(PR3)3'端非翻译区(UTR)进行缺失突变,研究其对突变菌株K4CPS合成的影响。研究表明:在ops序列(RfaH蛋白结合位点)存在时,PR3启动子强度和K4CPS产量与UTR的长度变化无关;但ops序列缺失时,UTR的延长可导致PR3启动子的强度和K4CPS产量均低于对照菌株;反之,UTR的缩短能显著提高PR3启动子的强度,进而使K4CPS产量比原菌增加了46%,达到751 mg/L。     

肝癌组织中HBV核心基因启动子突变的研究

为深入了解乙肝病毒 (HBV)致癌机理 ,用套式PCR对广西 14例血清HBVDNA阳性的原发性肝癌患者癌组织、10例乙型病毒性肝炎患者血清及 10例乙肝病毒无症状携带者血清HBV核心基因启动子进行扩增 ,阳性者用Sanger氏双脱氧法做序列分析 ,发现肝癌组织 10例PCR阳性 ,阳性率 71.4 % ,所有PCR阳性标本的整合体均有乙肝病毒核心基因启动子双突变序列 (nt 176 2A→T ,176 4G→A) ,并且在其周围各序列都有不同部位的点突变 ,标本C14核苷酸的缺失突变高达10个。乙肝患者 6例PCR阳性 ,其中 3例乙肝病毒核心基因启动子发生双突变。无症状携带者中 4例PCR阳性 ,其中仅 1例发生双突变。结果提示乙肝病毒核心基因启动子双突变在肝癌患者中较常见 ,肝炎患者次之 ,无症状携带者居最后。