干旱胁迫条件下发菜Ferritin差异表达与基因克隆

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,具有强烈的旱生生态适应性.运用双向电泳技术、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,发现发菜Ferritin在干旱胁迫条件下表达量逐渐降低.根据鉴定的Ferritin已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,获得了长度为540 bp的DNA,GenBank登陆号为HM854287.序列比较显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成.RT-PCR分析表明,Ferritin mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐降低,与Ferritin的表达趋势一致.将Ferritin基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(22.4 kD).实验结果可为进一步研究发菜耐旱的分子机理及探讨发菜对极端干旱环境的适应和保护机制奠定基础.     

发菜G6PDH基因(GND)克隆及其干旱胁迫下的差异表达分析

由GND编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是戊糖磷酸途径的关键酶。为了解发菜GND分子信息以及对干旱胁迫的响应机制,该研究设计了特异性引物克隆发菜GND全长,进行序列分析、原核表达和MALDITOF-TOF/MS鉴定,并对干旱胁迫下发菜GND的差异表达水平和G6PDH活性进行分析。结果表明:(1)发菜GND全长1 431bp(GenBank登录号为KX553955),与点形念珠藻(73102)的GND核苷酸序列相似性为96%,G6PDH氨基酸相似性为98%;氨基酸序列中第26和27位的Ile疏水性最强,在第302位的Arg亲水性最强,Thr有19个磷酸化位点,Ser有18个磷酸化位点,Tys有5个磷酸化位点,二级结构和三级结构主要由α螺旋、β折叠、β转角和随机卷曲构成。(2)将GND基因进行原核表达,获得47.23kD的外源表达蛋白G6PDH。(3)随干旱胁迫程度加剧,GND在转录水平的表达量和G6PDH活性均逐渐增加。研究结果为进一步探讨干旱胁迫条件下发菜GND表达调控奠定了基础。     

发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。     

大青杨PubZIP1基因的克隆及亚细胞定位与抗旱表达特性分析

从大青杨中克隆得到PubZIP1基因,通过基因测序结果可知,PubZIP1基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸。分析得出PubZIP1蛋白含有BZIP和DOG1两个结构域,其二级结构包括α-螺旋（62.50%）、无规卷曲（29.72%）、延伸链（5.56%）、β-折叠（2.22%）。通过亚细胞定位试验表明PubZIP1基因位于细胞核。通过qRT-PCR分析表明,在模拟干旱的不同7% PEG6000胁迫时间下,分析结果表明胁迫后PubZIP1基因在大青杨根中的表达量呈下降趋势。而在大青杨茎和叶片中的表达量呈上升趋势,尤其是在叶片中明显被诱导表达。预测该基因可能主要在叶片中表达并行使功能。     

发状念珠藻醛酮还原酶基因NfAKR的克隆与表达

以发状念珠藻细胞为试材,采用PCR技术克隆了醛酮还原酶基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfAKR。对基因序列特征进行了生物信息学分析,根据其编码氨基酸序列预测了NfAKR蛋白的三维结构,同时探讨了PEG-6000胁迫下NfAKR的表达特性。结果表明:NfAKR基因的编码序列长912bp,编码304个氨基酸,预测其编码蛋白的相对分子量为33.51kD,理论等电点为4.94,具有醛酮还原酶超家族保守结构域。NfAKR蛋白主要由10个α-螺旋和11β-折叠组成,中间形成一个疏水穴,作为酶的催化活性中心。NfAKR与点形念珠藻处在同一进化枝上,具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析显示,PEG-6000胁迫下NfAKR基因上调表达,当PEG-6000浓度为8%时,其相对表达量为5.66并达到峰值。依据NfAKR基因响应干旱胁迫上调表达的特性,推测醛酮还原酶可能参与发状念珠藻抵御干旱胁迫过程。     

吸水和干燥条件下发菜核糖体代谢差异表达基因分析

为解析发菜吸水和干燥条件下的基因差异表达规律以及发菜适应"干-湿"水分节律调控机制,该研究以充分吸水发菜藻体为对照组,干燥状态下的发菜藻体为处理组,采用高通量Illumina HiSeq PE150测序平台结合生物信息学分析方法对发菜吸水和干燥条件下的差异表达基因进行分析。结果显示:(1)发菜吸水和干燥条件下共鉴定到差异表达基因3 383个,其中显著上调和显著下调表达的基因数分别为1 767个和1 616个。(2)GO功能富集分析发现,在吸水和干燥条件下发菜差异表达基因主要富集在蛋白质合成与代谢等相关途径中;KEGG显著性富集分析发现,吸水和干燥条件下发菜有46个差异表达基因被显著富集到核糖体代谢途径,且均为显著上调表达,这些基因可能参与发菜对干旱胁迫的响应。(3)随机挑选6个被显著富集到核糖体代谢途径的基因进行qRT-PCR分析发现,其基因相对表达量与转录组测序结果一致。研究表明,发菜在干燥条件下可能通过激活核糖体代谢特定基因表达帮助抗旱相关的蛋白质的合成和正确折叠、并参与渗透调节等重要生理活动进而调控其适应干燥环境条件。     

发菜磷酸葡糖胺变位酶(glmM)对干旱胁迫的响应及其基因克隆

glmM编码的磷酸葡糖胺变位酶是肽聚糖合成前体的关键酶。为探究发菜glmM响应干旱胁迫的表达调控机制及明确其分子信息,本研究对干旱胁迫条件下发菜glmM在转录水平的差异表达进行了分析,并对glmM的表达水平、磷酸化修饰、乙酰化修饰和琥珀酰化修饰水平进行了检测,克隆了发菜glmM,进行了序列分析和原核表达。结果表明,干旱胁迫条件下,发菜glmM在转录水平上的表达量先增加后减少,glmM上调表达,glmM的磷酸化修饰水平逐渐增加,乙酰化修饰水平相对稳定,琥珀酰化修饰水平有明显变化。设计特异性引物克隆glmM基因,获得全长1416 bp发菜glmM基因,与肺衣(5183)glmM的核苷酸序列同源性为95%,氨基酸同源性为97%。将glmM在大肠杆菌中表达,获得一个51.45 kD的外源蛋白,MALDI-TOF-TOF/MS分析证明该蛋白为磷酸葡糖胺变位酶。研究结果为深入研究发菜glmM的分子信息、生物学功能及其响应干旱胁迫的分子机制提供帮助。     

核盘菌AROM蛋白的三级结构分析

核盘菌编码AROM蛋白的arom基因已经被克隆测序,本文根据该基因翻译的氨基酸序列用同源模建方法和从头模建方法分析了AROM蛋白各结构域的三级结构和功能位点,以及该蛋白二聚体可能的组装方式。结果表明,核盘菌AROM蛋白的脱氢奎尼酸合酶结构域进一步由N-端含有一个Rossmann折叠的α/β结构域和C-端的α螺旋结构域组成;5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶结构域则由两个相似结构域组成,每个结构域含有不同拷贝数的β折叠和α螺旋;莽草酸激酶结构域的N-端由三个β折叠组成;脱氢奎尼酸酶结构域为(α2β2)3多肽,在N-端有一对反平行的β链,在C-端有loop环;莽草酸脱氢酶结构域含有一个由α/β组成的催化结构域和一个含有Rossmann折叠的NADPH结合结构域。     

发菜固氮基因nifD和nifK克隆及其失水条件下的差异表达

nifD和nifK编码钼铁固氮酶中的钼铁蛋白。为了解发菜nifD和nifK分子信息及对水分胁迫的响应机制,该研究设计了简并性引物克隆发菜nifD和nifK全长,进行原核表达和生物信息学分析,并对不同失水状态下发菜nifD和nifK在转录水平的差异表达和固氮酶活性的变化进行分析。结果表明,发菜nifD和nifK全长分别为1 443 bp和1 536 bp (登陆号为分别为KU886164和KU886165);将nifD和nifK在大肠杆菌中表达,分别获得一个约57 kD和58 kD的外源蛋白;生物信息学分析表明,nifD和nifK核苷酸序列和推译的氨基酸序列均与点形念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)高度一致性;nifD和nifK的二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和随机卷曲。此外,随着藻体含水量的逐渐降低,发菜nifD和nifK在转录水平上的表达量逐渐增加,但固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为深入全面研究发菜固氮酶基因结构及其响应水分胁迫的固氮机理及氮代谢途径提供了基础。     

干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达分析

该研究以不同失水处理的发菜为研究材料,以充分吸水状态的发菜为对照,利用高通量测序技术和qRT PCR技术检测了干旱胁迫下发菜光合作用相关基因差异表达规律,并对光合色素和酶活在干旱胁迫下的变化进行了研究。结果表明：(1)发菜在不同程度干旱胁迫下有113个光合作用相关基因差异表达,其中失水30%、75%和100%的发菜分别有44个、74个和91个光合作用相关基因差异表达。(2)随着干旱胁迫程度的加深藻胆素、叶绿素a和类胡萝卜素含量逐渐降低,Rubisco活性随着干旱胁迫程度的增强先上升后下降,GAPDH活性随着干旱胁迫的增强呈现下降的趋势。研究表明,发菜通过光合作用相关基因的差异表达调控光合作用以适应干旱胁迫。该研究结果对进一步研究发菜干旱胁迫响应机制及其耐旱光合机理奠定了基础。     

太子参谷胱甘肽-S-转移酶基因家族生物信息学及表达分析

GSTs (glutathione-S-transferases)是一个普遍存在于植物体内,多基因家族编码的多功能蛋白酶。为研究GSTs基因家族在太子参中对其生长发育以及活性成分合成调控的潜在功能,该文基于隐马尔可夫模型在太子参中鉴定到30个谷胱甘肽-S-转移酶(PhGSTs)的基因家族成员。结果表明:30个PhGSTs基因同时具有高度保守的N-端结构域和复杂多变的C-端结构域,分属于6个亚家族,有10个motif区,其中motif1、motif 2、motif 3同属于所有家族,motif 4仅属于Tua亚家族。PhGST蛋白质三级结构有明显的相似之处,N端主要由3个α螺旋和4个β折叠构成βαβαββα结构域,C端均由α螺旋构成,不同亚家族的C端α螺旋数目及组合方式各不相同,但始终维持相似的三维结构。PhGST基因在太子参植物中具有不同的组织表达特异性,PhGSTU1、PhGSTU8、PhGSTU9等在太子参块根中优势表达,PhGSTF2在茎和叶中优势表达。水分胁迫处理后有4个基因积极响应干旱胁迫,PhGSTZ1的响应最为明显;同时也有PhGSTU8、PhEFB1γ3等4个基因随土壤含水量增加呈上调表达。该文鉴定出30个PhGST基因,并分析了其在太子参中的表达模式,为PhGSTs基因家族在太子参活性成分的合成调控及逆境响应等生理过程中的功能研究奠定理论基础。     

沙蒿AQP基因结构预测及干旱胁迫下的时空表达模式研究

为探究水通道蛋白(AQP)在沙蒿响应干旱胁迫中的作用机制,该研究以青海省柴达木盆地沙蒿为试验材料,采用RACE技术对其AQP基因进行扩增,获得沙蒿AQP全长克隆并对AQP蛋白进行结构预测和分析;采用qRT-PCR对沙蒿AQP基因在不同程度干旱胁迫以及不同组织部位的表达模式进行分析。结果表明:(1)成功克隆获得沙蒿AQP基因长746 bp的片段1和长534 bp的片段2,经拼接后得到全长cDNA序列,沙蒿AQP基因总长为864 bp。(2)亚细胞定位表明沙蒿AQP基因定位于细胞膜上;同源比对显示沙蒿与向日葵、莴苣、橡胶树等植物的AQP基因具有较高的相似性;结构预测表明AQP蛋白含6个跨膜螺旋结构且亲水性较弱,α螺旋和无规则卷曲为AQP蛋白二级结构的主要构成元件。(3)qRT-PCR分析表明,沙蒿AQP基因随着干旱胁迫的加重呈现有规律的变化,根、茎、叶中表达均上调,且叶中AQP基因表达量上调幅度最大。研究表明沙蒿AQP基因结构特征及其表达模式都是沙蒿对干旱胁迫的一种适应。     

一个特异水稻原纤蛋白FBN11的生物信息学和基因表达特性分析

Fibrillin 11(FBN 11)是植物质体中FBN蛋白家族的重要成员之一,比其他成员多300~500个氨基酸残基,说明其可能存在某些特异性结构和功能。本研究在水稻幼苗中扩增获得到了一个受非生物逆境胁迫诱导的OsFBN11基因的全长cDNA,该基因含有12个内含子和13个外显子。其编码蛋白的分子量为72.36 kD,pI值为9.26。生物信息学分析结果表明,该蛋白含有无规则卷曲、α螺旋和β-折叠3种氨基酸二级结构,不含有跨膜结构域,蛋白亲水性强,PSORT软件预测该蛋白可能定位于叶绿体中。进一步对14种植物FBN11蛋白的同源性和5个物种该蛋白的保守结构域分析,发现该蛋白兼有典型的PAP-Fibrillin结构域和蛋白激酶PKc结构域。水稻全生育期芯片分析显示该基因主要在愈伤组织、叶片和根系中高水平表达。RT-PCR检测结果显示,该基因在水稻幼苗中受ABA、NaCl和干旱胁迫处理上调表达。上述结果表明,OsFBN11可能在水稻质体发育和抗非生物胁迫反应中发挥重要作用。     

日本落叶松LoERF017基因的克隆及生物信息学分析

从日本落叶松中克隆得到的LoERF017基因，该基因全长624 bp，共编码206个氨基酸。预测该基因所编码的蛋白只包括一个AP2结构域，其二级结构包括α-螺旋（30.43%），无规卷曲（54.11%），延伸链（12.56%），β-折叠（2.9%）。对该基因进行亚细胞定位，结果显示LoERF017基因定位在细胞核中。荧光定量PCR结果表明，LoERF017基因在日本落叶松中的表达有一定的组织特异性，该基因在根中的表达量最高，在茎中的表达量最低，在叶中的表达量居中。干旱胁迫下，LoERF017基因的表达量在根中呈上升趋势，复水后，该基因的表达量有下降趋势。可以初步预测该基因主要在日本落叶松根中表达并行使功能，并推测该基因可能与抗旱相关。     

高粱LEA基因家族的鉴定及表达分析

有研究表明,干旱、低温和盐等环境胁迫能够诱导LEA基因的表达。为了探索LEA基因家族在高粱响应外界刺激过程中起到的作用,本研究通过生物信息学的方法对LEA基因家族在高粱全基因组水平进行鉴定和分析,于高粱全基因组中共鉴定出35个基因家族成员,不均匀地分布于高粱8条染色体上,结合系统进化树和保守结构域分析结果,将高粱LEA基因家族成员分为7组。亲水性分析和结构无序性预测表明高粱LEA蛋白绝大多数为亲水性且结构无序。基因结构分析显示了各分组基因结构上的保守性。高粱LEA基因的启动子分析发现了一些与激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。对激素和干旱胁迫下高粱LEA基因的表达分析发现外界胁迫能够诱导部分高粱LEA基因的表达。     

普通烟草RAV家族基因结构与功能分析

揭示RAV基因在普通烟草中的表达过程及其在生物和非生物因子胁迫下的作用,对于烟草抗逆育种具有重要意义。采用生物信息学手段和qRT-PCR技术分别对普通烟草RAV家族基因进行生物信息学分析、研究该基因在低温和脱落酸(ABA)诱导下的表达模式。分析发现,与拟南芥RAV基因同源的普通烟草RAV基因序列有6条,且与茄科植物同源关系较近;通过结构组成分析,发现RAV蛋白主要由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链组成,该家族基因氨基酸序列基本含有AP2和B3结构域,且两个结构域均具有非常强的保守性;表达模式分析显示,普通烟草RAV基因表达部位呈现出明显的组织特异性,且低温和ABA均能诱导该基因上调表达,表明该基因在烟草响应非生物胁迫中发挥重要作用。     

茶树CsGIF1基因的克隆及其对非生物胁迫的响应分析

GRF-INTERACTING FACTOR(GIF)基因是植物叶发育相关的一类重要调控因子,调节植物叶器官的发育。该研究采用RT-PCR方法从茶树‘龙井43’的叶片cDNA中克隆得到CsGIF1基因,并利用荧光定量PCR分析了高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L-1 PEG)、盐胁迫(200mmol·L-1 NaCl)下CsGIF1基因的表达水平,以明确CsGIF1基因对非生物胁迫的应答特性,为茶树CsGIF1基因的逆境调控以及功能研究奠定基础。结果表明:(1)CsGIF1基因长666bp,编码221个氨基酸,具有高度保守的SNH结构域;CsGIF1蛋白为亲水性蛋白,理论相对分子质量为23 380,理论等电点为6.30;酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸所占比例分别为7%、9%、5%和13%;蛋白质二级结构显示,茶树CsGIF1蛋白由38.01%的α-螺旋、10.41%的β-折叠、12.22%的延伸主链和39.37%的随机卷曲组成。(2)qRT-PCR分析显示,茶树CsGIF1基因对于4种非生物胁迫均有响应,但不同处理响应不同。其中在胁迫2h时,高温和低温胁迫下,CsGIF1基因相对表达量显著增加,分别为对照的3.54和5.69倍,且高低温胁迫下,CsGIF1基因响应明显大于干旱和盐胁迫。在高温、低温、干旱、盐等不同胁迫处理下,茶树‘龙井43’中CsGIF1基因的表达水平与对照相比均差异明显。     

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能研究进展

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白的毒性肽由三个典型的结构域组成.结构域Ⅰ位于肽链的N端,为一组由6～7个两亲的α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α螺旋束,参与了细胞膜的穿孔;结构域Ⅱ位于肽链的中间,为三组以“希腊钥匙”（Greek key）拓扑结构连接在一起的反平行的β折叠片层,其顶端的突环参与了毒素与受体蛋白的结合;位于C端的结构域Ⅲ是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构,以β果酱卷(jelly roll)拓扑结构排列,可能能够防止蛋白酶对毒素分子的过度降解.     

甘蔗ScHAK9基因克隆及表达分析

KUP/HAK/KT家族基因在介导细胞内钾的积累及维持植物的生长发育中起重要作用,本研究以新台糖22号(ROC22)甘蔗为研究材料,采用同源克隆技术获得钾转运ScHAK9基因的完整编码序列(CDs),并利用生物信息学软件对蛋白质结构和功能进行预测分析,同时利用qPCR技术分析基因的组织特异性表达以及在不同干旱条件下的表达情况。结果表明,ScHAK9基因的cDNA完整编码区长度为2352 bp,编码783个氨基酸,属于碱性疏水蛋白,结构中包含了12个跨膜结构域,蛋白主要定位在细胞质膜上;蛋白质二级结构主要由α螺旋结构、无规则卷曲结构和扩展长链组成;系统发育树分析显示ScHAK9与玉米Zm HAK9基因同源性较高。qPCR分析结果表明,ScHAK9基因在不同组织间的相对表达量具有明显差异,叶片中表达最高,其次是茎,根系中表达最低,具有组织特异性;干旱胁迫可以诱导ScHAK9基因表达,其表达量随着胁迫程度加重表现出升高趋势,且在复水后才有所下降。初步推测该基因可能在甘蔗发育和抵御干旱胁迫中起着重要作用,本研究为进一步阐明ScHAK9的功能及作用机制奠定了分子基础。