散斑壳属真菌RAPD-PCR反应条件的优化

以分离自四川省二郎山林场云南松上的松针散斑壳菌(Lophodermium pinastri)为材料,提取其总基因组DNA做为RAPD-PCR体系优化的模板。研究了dNTPs、Mg~(2+)、DNA模板、Taq酶、引物等组分对RAPD反应结果的影响,并建立了最佳反应体系:25μL PCR反应体积,10×Taq酶缓冲液2．5μL,1．5 U Taq酶,20 ng DNA模板,0．4 mmol/L dNTPs,4．0 mmol/L Mg~(2+),0．48μmol/L引物,10．2μL ddH_2O。     

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

为了对狗牙根进行SSR-PCR分子标记分析,本研究对狗牙根的SSR-PCR反应体系进行了优化,利用L16(45)正交设计对狗牙根SSR-PCR反应体系中的Taq酶、Mg~(2+)、dNTPs和引物4个因素的多个水平进行了筛选,PCR结果用SAS进行方差分析,并利用筛选出的最优体系对退火温度进行了筛选。结果表明:(1)Taq酶、Mg~(2+)和引物3个因素对狗牙根SSR-PCR扩增结果有极显著影响,影响程度为Taq酶Mg~(2+)引物,而d NTPs对扩增结果影响不显著;(2)筛选出了20μL的狗牙根SSR-PCR最优反应体系为0.5 U Taq酶、2 mmol/L Mg~(2+)、0.4μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs、30~60 ng模板DNA;(3)退火温度50~62℃对本试验所选引物的SSR-PCR扩增结果影响不大,本研究选用55℃作为退火温度。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

水稻RAPD反应体系的正交优化

以焦旱1号总DNA为材料,首先对影响RAPD-PCR反应的模板DNA、Mg~(2+)、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶浓度等因素进行了初步优化,分析了各因素对RAPD-PCR扩增结果的影响.在此基础上对影响RAPD-PCR反应的Mg~(2+)、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶浓度等4个主要因素进行正交优化,研究结果表明:在25 μl RAPD-PCR反应体系中,模板DNA 20 ng;Mg~(2+)浓度1.5mmol/L;dNTP的浓度0.2mmol/L;引物量15 pmol;Taq DNA聚合酶1.0 U.在此最佳条件下,利用引物B8对18个北方粳稻品种进行了成功的扩增.     

散斑壳属ISSR-PCR反应条件的优化

以散斑壳属 (Lophodermium) T29、T50、T62、R111菌株为研究材料,对该属ISSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及退火温度等条件进行优化,寻找出适合此类真菌ISSR-PCR反应的最佳反应体系为15 μL反应体系中,模板DNA浓度为 4～8 ng/μL、引物浓度 0.4～0.5 μmol/L、Mg2 浓度 2.0～2.5 mmol/L、dNTPs浓度 0.15～0.30 mmol/L、Taq DNA聚合酶量1.5～2.5 U,退火温度为 52 ℃.     

黑籽南瓜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

以云南个旧黑籽南瓜叶片基因组DNA为模板,固定反应程序,采用L_(16)(4~5)正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的五因素(dNTPs,Mg~(2+),引物,Taq DNA聚合酶,模板DNA)在四个水平上进行优化试验。研究建立起了适于云南黑籽南瓜ISSR-PCR的最佳反应体系:25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl、0.15mmol/L dNTPs、2.5mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、1.5U Taq DNA聚合酶、DNA模板15ng。扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,进行35个循环,最后72℃延伸7min。该优化体系的建立为今后用ISSR标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

利用正交设计优化异色瓢虫SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45)对异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验,试验结果用DPS和MINITAB软件进行分析,建立了异色瓢虫SRAP-PCR反应的最佳体系,即在20μL体系中模板50~100ng、引物0.25μmol/L、dNTPs0.1mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5U、Mg2+0.375~0.625mmol/L。并对反应体系进行梯度退火试验,得到最佳退火温度为50.3℃。这一优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行瓢虫遗传图谱的构建、多态性分析和基因定位奠定了技术基础。     

正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选

旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物。以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用正交试验方法,对d NTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验,采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析。并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,d NTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA浓度为60 ng,10×PCR Buffer体积为2μL、剩下用灭菌ddH_2O补全。各因素影响大小依次是:Mg~(2+)d NTPs模板DNATaq DNA聚合酶引物。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次,72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

荔枝DNA提取及RAPD扩增条件优化

为应用RAPD技术开展对荔枝种质资源的分析,以S43(GTCGCCGTCA)为引物,通过试验设计,分别研究了退火温度、模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量对荔枝RAPD-PCR反应的影响。建立并优化了适宜荔枝RAPD分析的扩增体系:20μL的反应体系,30ng的模板DNA度,0.25μmol/LRAPD引物、1.0UTaqDNA聚合酶,0.2μmol/LdNTP为荔枝适宜的RAPD-PCR扩增条件。     

栝楼ISSR-PCR体系的正交优化

目的：建立栝楼最佳ISSR-PCR正交优化体系,为开展栝楼ISSR分子标记奠定技术基础。方法：采用正交试验设计对影响栝楼ISSR-PCR扩增的重要参数（DNA模板、MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化试验,同时进行不同温度梯度试验和ISSR体系筛选。结果：最佳的栝楼ISSR-PCR的反应体系（20μl）为：30ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl2,0.3mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃-55℃;扩增反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。结论：建立了栝楼的最佳ISSR反应体系,为栝楼种质鉴定提供了更客观可靠     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化

采用改良CTAB法从观赏桃满天红叶片中提取基因组DNA,通过单因素实验探讨了模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs和Taq DNA酶等条件对观赏桃ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了ISSR-PCR扩增的最佳体系:2.5μl反应体系中包含10×Buffer 2.5μl,模板DNA 40ng,Mg~(2+)浓度2.5mmol/L,引物浓度04 μmol/L,dNTPs浓度0.4mmol/L,Taq DNA酶0.5U.利用所建立的体系对红叶桃、菊花桃和春艳等13份材料进行检验,其结果表明优化后的体系适合观赏桃的ISSR-PCR反应.     

杨梅RAPD-PCR体系的正交优化研究

以杨梅DNA为模板,对影响杨梅RAPD-PCR扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立杨梅RAPD反应的最佳体系。通过采用正交试验设计的方法,对杨梅RAPD-PCR条件进行了优化,结果表明最佳的杨梅RAPD-PCR的反应体系(20μl)中含有1×buffer,1.0U TaqDNA聚合酶,3.0mmol/L MgCl2,0.30mmol/L dNTPs,1.5μmol/L引物和模板DNA 30-40ng。适宜的扩增条件为94℃预变性3min,再进入38个PCR循环(94℃变性30s,38℃退火30s,72℃延伸90s),72℃延伸7min,4℃保存。     

余甘子ISSR反应体系的优化

应用ISSR技术开展余甘子遗传变异分析、辅助育种、品种鉴定、系统进化等研究,以(TC)8C为引物,采用正交设计和单因素试验,研究余甘子基因组DNA的浓度、退火温度、引物浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量对余甘子ISSK-PCIR反应的影响,建立并优化了适宜于余甘子ISSK分析的扩增体系:20μl的反应体系中采用25ng的模板DNA、0.35μmol/L ISSR引物、1.25U Taq 酶,0.3mmol/L dNTPs,引物(TC)8C的最佳退火温度为51.7℃.     

长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究

采用SDS(十二烷基硫酸钠,20%)法提取了大型海藻长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)基因组DNA.通过单因子梯度试验,确定了影响随机扩增DNA多态性(RAPD)扩增结果的模板、Mg2 、dNTPs、S22引物、Taq的适宜浓度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg2 、dNTPs、S22引物、Taq的配比浓度.结果表明,在进行长心卡帕藻的RAPD扩增时,在总体积为25μl的反应体系中,模板、Mg2 、dNTPs、S22引物、Taq的最佳浓度分别为15ng、2.0mmol/L、0.2mmol/L、0.25μmol/L、2.5U;退火温度为37℃.反应程序为94℃预变性5min,然后经94℃变性30s、37℃退火1min.72℃延伸2min,进行30次循环,最后在72℃再延伸10min.     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

黄鳝ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

以黄鳝基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化.建立了黄鳝的最适ISSR-PCR反应体系,25 μl反应体系中含2.5 mmol/ L Mg2+,250 μmol/ L dNTPs,0.25 μmol/ L 引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,30 ng DNA模板.最佳反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,48～57℃复性40 s(随引物而确定),72℃延伸1.5 min,循环次数40;72℃延伸10 min.利用所建立的ISSR反应体系,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带.     

益智ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：获得适合的益智ISSR-PCR扩增反应体系。方法：利用正交设计L46（4^5）和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素（Taq酶,Mg^2＋,模板DNA．dNTPs,引物）在4个水平上进行优化试验,将二者所得结果进行综合比较分析。结果：最终扶得益智ISSR-PCR反应的最优体系（20μl）为：模板DNA 100ng,Mg^2＋ 3．0mmol／L,引物0．8μmol／L,dNTPs0．25mmol／L,Taq DNA聚合酶1．0U。最后,对益智ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为50℃。结论：这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。     

节瓜ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

旨在开展节瓜种质资源分类鉴定与遗传多样性研究。通过正交试验设计与单因素分析相结合的方法,对节瓜ISSR-PCR反应体系5个因素(模板DNA浓度、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度与Taq聚合酶浓度)在4个水平上进行优化分析,建立了节瓜稳定可靠且具丰富多态性的最佳反应体系,进而对引物退火温度进行梯度试验分析。结果表明,20μL节瓜ISSRPCR最佳反应体系为70 ng模板DNA、0.2 mmol/L dNTP、1.2 mmol/L Mg2+浓度、0.96μmol/L引物、0.8 U Taq DNA聚合酶和2.0μL10×buffer;引物IS807最佳退火温度为53℃。以此为基础,利用4条引物对4份节瓜种质进行最佳反应体系稳定性验证,证明该体系稳定可靠、扩增谱带清晰、多态性丰富且重复性较好。