RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP),CLIP cDNA文库高通量测序(high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP(individual nucleotide resolution CLIP,i CLIP),TRIBE(targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC)和Ser IC(serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。     

RNA结合蛋白与RNA互作鉴定技术

RNA结合蛋白（RNA binding proteins,RBPs）通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）研究的快速发展,催生了多种RBPs RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了 RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀（ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP）,CLIP cDNA文库高通量测序 (high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP (individual nucleotide resolution CLIP,iCLIP),TRIBE (targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA 标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC) 和SerIC (serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。     

紫外交联免疫沉淀技术原理及其应用

紫外交联免疫沉淀（UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP）技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白（RNA-binding proteins,RBP）的靶标RNA序列和结合位点。在近20年的应用过程中,该技术被不断改进和完善,可操作性、实验结果的准确性都有所提升,技术的应用范围也有所拓展。本文对CLIP技术的基本原理、实验方法、实际应用进行介绍,着重比较几种主流CLIP技术的异同,并对如何选择具体的技术路线提出建议。     

棉花锌指蛋白GhZFP1相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

GhZFP1蛋白是从盐胁迫棉花幼苗cDNA文库中分离的一种CCCH型锌指蛋白.初步的生物学功能研究表明,过量表达该基因的转基因烟草耐盐性和抗病性显著提高.为深入研究GhZFP1蛋白的作用机制,构建pGBKT7-m1诱饵表达载体,利用酵母双杂交系统从盐胁迫诱导棉花cDNA文库中筛选与其相互作用的蛋白.通过阳性克隆的表型确定、PCR和限制性内切酶检测以及测序和生物信息学分析,获得9个与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白.双分子荧光互补实验证明,GhZFP1与GZIRD19A确实存在互作关系.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究GhZFP1锌指蛋白的未知生物学功能提供重要信息.     

中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交文库的构建

【目的】本研究旨在利用位点特异性重组技术(FullCoV)将中华蜜蜂 Apis cerana cerana 幼虫膜蛋白cDNA连接到pPR3-N载体上,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库。【方法】提取2-3日龄中华蜜蜂工蜂幼虫总RNA;分离mRNA后,在反转录酶的作用下合成幼虫膜蛋白cDNA第1链,并合成双链cDNA。在双链cDNA的5′端加上带有重组序列的接头后,通过FullCoV技术与载体pPR3-N进行连接,然后将连接产物电转化到DH10B感受态细胞,构建中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并对该文库插入片段大小和文库滴度进行检测。【结果】通过FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,经检测,中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库的总库容量为1.5×10^7 cfu,文库滴度为3×10^6 cfu/mL,重组率达到100%。【结论】本研究利用FullCoV技术成功构建了中华蜜蜂幼虫膜蛋白酵母cDNA文库,为进一步探究感染中华蜜蜂的病原微生物与宿主蛋白互作研究奠定了基础。     

烤烟品种南江3号均一化全长cDNA文库构建

目的:为了获得功能基因的信息,构建烤烟品种南江3号的均一化cDNA文库.方法:用RNeasy Plant Mini Kit提取烤烟南江3号叶片和花的RNA,用反转录酶逆转录合成第一链eDNA.以LD-PCR扩增获得的双链cDNA为模板,采用基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,DSN)的均一化cDNA文库技术,构建南江3号盛花期的均一化cDNA文库.结果:构建了南江3号盛花期的均一化cDNA文库,文库重组率大为97.47%,库容量约为1.26×10<'6>,插入片段平均长度大于1.2kb.从文库中随机48个克隆进行PCR检测,挑取20个克隆进行测序,序列通过BLAST比对结果显示文库可能包含大量基因和ESTs序列.结论:该文库为研究南江3号的基因功能和资源提供材料来源.     

细菌双杂交筛选大豆GmWNK1互作蛋白系统的建立及应用

本研究利用大肠杆菌双杂交系统构建了一个高质量的大豆根系cDNA文库,同时利用大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建了融合表达质粒pBT．GmWNK1,经酶切和测序鉴定、诱饵融合蛋白的表达检测及诱饵融合蛋白的自激活鉴定后作为诱饵,从大豆根部cDNA文库中筛选与GmWNK1发生互作的蛋白质,共获得18个阳性克隆。经测序和同源性比对发现,有10个阳性克隆编码已知蛋白,8个为假阳性。研究结果为揭示WNK基因家族的生物学功能和调控机制提供了重要的参考数据和研究材料。     

基于高通量测序鉴定细菌RNA加工位点方法的开发（英文）

简便的RNA剪切加工位点鉴定方法对于细菌核糖核酸内切酶功能和转录后水平调控机制的研究至关重要。本研究基于第二代测序技术,开发了一种能够精确鉴定RNA剪切加工位点及其剪切效率的高通量测序方法。在该方法中,首先将各种潜在RNA剪切加工的DNA片段分别克隆至报告系统进行转录,然后利用其下游特异引物进行反转录,直接构建约500 bp的双端测序cDNA文库,并在Illumina MiSeq平台对该文库进行测序。最后通过对reads 5′末端的比对定位,精确测定发生RNA剪切的位点。利用该方法,成功鉴定了来自Ruminiclostridium Cellulolyticum的cip-cel mRNA中的3个RNA剪切加工位点。与传统引物延伸和5′RACE等方法相比,该方法不仅具有更高的安全性和通量,同时还可像Northern印迹鉴定RNA的剪切效率。     

常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及ADAMs相关基因的免疫筛选与序列分析

抽提常氏肝癌细胞的总RNA,以oligo(dT)为引物,通过两次转换模板,采用LD-PCR合成全长cDNA,在cDNA两端引入SfiI的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cDNA表达文库。以ADAMs通用抗体,用免疫筛选技术从常氏肝癌cDNA文库中筛选出22个阳性克隆,经测序分析和BLAST检索,证实其中一个为新基因,部分区域具有蛋白酶的功能,对该基因进行了GenBank登录,获注册号为AY078070。该基因的克隆为研究ADAMs相关基因的功能奠定了基础。     

一种结合SELEX与二代测序技术筛选RNA结合蛋白特异识别序列新方法的建立

RNA结合蛋白通过特异识别RNA底物发挥重要的生物学作用。指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术是一种体外筛选核酸底物的基本方法,SELEX技术通过重复多轮筛选从随机核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸底物,本研究将利用该技术与二代高通量测序(NGS)相结合,体外合成含有20个随机碱基的RNA文库,将所要研究的蛋白构建到带有可被链亲和酶素磁珠捕获的SBP标记的载体上去,显著提高筛选效率,仅需1轮筛选即可获得所需RNA底物motif。通过该方法获得了人的hn RNP A1的UP1结构域特异识别AGG和AG二种RNA序列,并通过EMSA实验证实其可以与获得的RNA motif结合。这一方法的建立对于研究RNA结合蛋白识别底物的序列特异性,并进一步了解其在生物体内的调控机制有重要意义。     

豌豆核糖体小亚基蛋白S21的cDNA克隆、序列分析及在G2豌豆中的表达研究

以G2豌豆幼苗为材料,构建了滴度为6.5×106pfu的cDNA文库,用同源序列筛选法从该文库中得到一个全长465bp的cDNA。杂交分析认为它是一完整的cDNA序列。DNA序列分析表明,它拥有一个282bp的开放读码框,编码94个氨基酸。计算机同源序列比较发现,它可能编码豌豆核糖体小亚基蛋白S21(RS21-PEA),因为该序列与已知的玉米、水稻S21在氨基酸全序列水平上有32%～35%的同源性,并含有与RNA结合的特征结构域。进化树分析显示S21蛋白可在一定程度上反映生物的进化及遗传变异趋势。     

asr基因酵母双杂交系统的构建及筛选鉴定

为研究asr作用的分子机制,分析该基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白,分别构建诱饵质粒载体和转基因拟南芥cDNA文库,通过转入酵母细胞中,初步的鉴定分析证实成功构建了诱饵质拉载体和拟南芥cDNA文库.构建的酵母双杂交系统为发现asr基因表达产物在体内相互作用的靶蛋白奠定了基础.     

Gateway技术构建菊芋块茎全长cDNA文库及EST测序分析

为丰富菊芋功能基因组学研究基础平台,以成熟期菊芋块茎为材料,将菊芋全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了菊芋非剪切型全长cDNA文库。文库质量分析表明:未经扩增的原始文库库容量为5.76×10~6 CFU,插入片段大小主要为1～3000 bp,重组率为100%(24/24),达到了高质量文库的标准。利用该文库进行表达序列标签(expressed sequence tag, EST)测序,得到2639条高质量的EST序列,拼接后获得1895条非重复的唯一表达序列(unigene)。与NCBI的NR数据库同源比对分析表明,共有1533条unigene(80.9%)与已知基因有显著的同源性。GO分类结果显示:菊芋块茎表达基因在分子功能类群中,结合和催化活性所占比例最高。此cDNA文库将可用于菊芋功能基因组研究、新基因筛选、高通量EST测序以及菊芋cDNA芯片的制备等。     

巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子倾卵囊cDNA表灰文库,从E.maxima孢子化卵囊中提取总RNA,以总RNA为模板、λTriplex2TM为栽体,利用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA表达文库.经测定构建的E.maxima cDNA表达文库的原始文库容量为1×106 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5×1010pfu/ml,重组率为95%,插入片断主要集中在0.5～1kb之间.根据已知序列设计引物,能从文库中扩增出编码E.maxima免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列片段.结果 表明所构建的E.maxima cDNA表达文库质量良好,为克隆、筛选E.maxima的功能性基因奠定了基础.     

三丁基锡暴露条件下杂色鲍肝胰腺均一化cDNA文库的构建

用RDP试剂提取三丁基锡暴露诱导的杂色鲍肝胰腺总RNA,经Oligotex纯化得到 mRNA;应用SMART技术合成双链cDNA,双链特异核酸酶(DSN)进行双链cDNA的均一化,构建了杂色鲍三丁基锡暴露诱导下的均一化cDNA文库.原始文库的库容为4.3× 106 CFU/ml,重组率为 97.9%.从文库中随机挑选了3 288个克隆进行测序,得到3 048个高质量EST序列,其中有 370条 Contigs,2 103条 Singlets,Unigenes共 2 473条,冗余率为18.86%.以上结果说明该文库质量较好,为进一步筛选相关功能基因打下基础;较低的冗余率说明该文库值得继续使用大规模ESTs测序的方法寻找相关功能基因,并为进一步使用基因芯片技术研究相关功能基因的表达谱提供便利.