牛乳头瘤病毒基因2型新疆南疆Aks-01流行株全基因组序列测定及其特征分析

为从分子水平了解牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus,BPV)新疆南疆Aks-01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况。本研究选取新疆南疆患病牛皮肤肿瘤样物,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR法基因分型鉴定并确定其基因型,根据GenBank中BPV参考株设计扩增引物和测序引物,对Aks-01株进行全基因组扩增、测序及序列分析。序列分析表明,新疆南疆Aks-01株为BPV-2基因型,其全基因组长为7944bp,具有BPV-2基因型的结构特征,与GenBank收录的BPV-2基因型参考株核苷酸比较,同源性高达98%。与BPV-1、BPV-13的基因型参考株进化关系最近,同属Delta属。该Aks-01株为新疆南疆地区首次检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。     

牛冠状病毒BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列测定及其分子特征分析

为掌握牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)BCV-Aks-01新疆南疆株的全基因组序列、分子结构特征及遗传变异情况。本研究以新疆南疆某牛场BCV-Aks-01阳性样本为基础,以GenBank中BCoV参考株设计扩增引物和测序引物,提取样本中病毒核酸,对BCV-Aks-01株进行全基因组扩增、测序、构建系统发生树及序列分析。结果表明,BCV-Aks-01新疆南疆株为BCoV,其全基因组长为30 975bp,与GenBank收录的参考株比较,核苷酸同源性高达98.8%,属于β类冠状病毒2a亚类,具有β类冠状病毒共同结构特征。首次获得BCV-Aks-01新疆南疆株全基因组序列并阐明了其基因组分子结构特征。     

F基因型腮腺炎病毒全基因组基因特征分析

为了解我国现流行的F基因型腮腺炎病毒全基因组的基因特征,本研究选择对腮腺炎病毒F基因型参考株MuVi/Shandong.CHN/4.05[F]进行全基因组测序,结合其它来自于GenBank的腮腺炎病毒全基因组序列,共同分析我国流行的F基因型腮腺炎病毒的全基因组特征及其与现有疫苗株的遗传差异及抗原位点变异情况。通过研究发现,和腮腺炎病毒其它基因型相比,腮腺炎毒株MuVi/Shandong.CHN/4.05[F]全基因组核苷酸差异在3.8%~6.5%之间,其中与A基因型(疫苗株)差异最大,与B和N基因型差异最小。腮腺炎毒株MuVi/Shandong.CHN/4.05[F]和疫苗株在全基因组序列上分别存在26个和25个N-糖基化位点,和疫苗株相比,腮腺炎毒株MuVi/Shandong.CHN/4.05[F]在HN蛋白上第464~466氨基酸位点上增加了一个N-糖基化位点,而其它基因型的腮腺炎病毒在这个位点上也均为N-糖基化位点。另外,腮腺炎毒株MuVi/Shandong.CHN/4.05[F]和疫苗株在其它已知的抗原相关位点上也存在着氨基酸变异。我国现流行的腮腺炎流行株与腮腺炎病毒其它基因型及疫苗株之间在全基因组上已存在较大的差异,提示需进一步加强对国内现有腮腺炎流行株与疫苗株之间的遗传变异分析,系统评价当前疫苗的免疫保护效果。     

利用长距离PCR扩增国内肠道病毒流行株基因组方法的建立和评价

目的:通过调查近年来我国肠道病毒EV-71型和柯萨奇病毒A16型流行株的全基因组序列,建立一种能够获得我国肠道病毒序列的通用扩增方法,为今后的手足口病流行病学分析、致病机理研究等打下基础。方法:收集我国近5年各地报道的肠道病毒流行株全基因组序列作为参考序列进行比对分析,在保守区设计通用引物,利用3'RACE、长距离PCR扩增及简并引物扩增肠道病毒全基因组序列,采用IonTorrentPGM二代测序仪对扩增产物进行深度测序,以对扩增方法进行验证和评价。结果:通过比对肠道病毒流行株序列设计了通用扩增引物,经二代测序实验获得了肠道病毒全基因组序列;以系列比例模拟混合病毒感染,该扩增方法能够同时获得2株肠道病毒的全基因组序列;能够完整地揭示肠道病毒重组情况。结论:建立了针对我国近年来肠道病毒流行株的通用全基因组扩增方法,在病毒培养液中肠道病毒的提取与扩增中显示了较高的灵敏度,能够反映混合病毒感染、重组病毒的情况。     

一起荷斯坦奶牛乳头瘤病诊断及其病毒基因型分析

牛乳头瘤病毒是一种能够引起牛发生皮肤乳头状瘤、纤维素瘤、膀胱和食道癌的DNA病毒,现已在牛群中广泛传播,对牛养殖业造成了重大经济损失.为了诊断甘肃某荷斯坦奶牛场300多头泌乳期奶牛乳头突发疣状物的病因,本研究采用流行病学调查、临床观察、组织病理学、分子生物学检测方法和基因测序技术,对患有疣状物的奶牛进行综合诊断.结果 表明,乳头患疣状物奶牛的其它部位无类似生长物,无发烧、疼痛等异常临床症状,组织病理学HE检测疣状物呈现角化过度和细胞空泡化现象,这与牛乳头瘤病毒感染的组织病理变化相似,并且用PCR方法获得了牛乳头状瘤病毒L1基因,测序比对结果显示为乳头瘤病毒7型基因,核苷酸同源性达98％以上.因此,本次荷斯坦奶牛乳头突发疣状物为乳头瘤病毒7型感染引起的,这是甘肃地区首次发现该基因型乳头瘤病毒,应引起奶牛场与防疫部门的重视.     

浙江地区鼬獾和犬源狂犬病病毒分离株全基因组测序与分析

测定浙江地区狂犬病病毒分离株(鼬獾和犬)全基因组序列,从分子水平对病毒进行遗传变异特征分析,了解狂犬病病毒在浙江的流行和变异情况以及目前浙江流行株的遗传学背景,以丰富中国狂犬病病毒街毒流行株的全基因组信息。脑内接种1~2日乳鼠分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定浙江地区狂犬病病毒分离株全基因组核苷酸序列,并进行编码蛋白和序列相似性比较及种系发生分析。测序获得狂犬病病毒浙江淳安鼬獾分离株F02、F04和松阳犬分离株D01、D02全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923和11 925 nts,前导序列Leader长58nts,5个ORF为:NP(1 353 nts);PP(894 nts);MP(609 nts);GP(1 575 nts);LP(6 386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间的伪基因Ψ长423 nts;Trailer尾长70 nts。核酸BLAST及多重序列比对分析显示浙江地区4个狂犬病病毒分离株的全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病病毒属的特征;中国毒株之间特别是浙江同种动物狂犬病病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,浙江病毒全基因组序列编码蛋白氨基酸序列相似性高于核苷酸序列相似性,说明蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变;浙江病毒负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,5个编码蛋白仅表现较少的序列变化;浙江病毒与本研究选择的代表性引用街毒株或者来自街毒的减毒株的变异位点和变异类型相似,多重序列相似性的比较和种系发生分析显示所分离的狂犬病病毒浙江街毒株均属于基因1型,具有较独特的中国地域性特点,故本研究中的浙江地区分离株极有可能是自然界中固有的街毒株。     

山东一株鹦鹉幼雏病病毒全序列测定与分析

目的:对青岛即墨地区发病的濒死鹦鹉进行诊断,并对BFDV进行全基因测序,分析其遗传进化规律.方法:利用PCR对发病鹦鹉进行BFDV的检测,并设计引物进行BFDV全基因组的测序.结果:BFDV核酸扩增为阳性,经PCR分段扩增法获得全基因组并完成了序列测定.QDJM01株全序列测定结果与GenBank中仅有的七株BFDV全序列进行同源性比较与进化树分析.经BLAST和DNAStar软件分析,QDJM01与其他七株BFDV同源性为99.0%～99.6%,为同一个基因型.结论:此病例为鹦鹉幼雏病病毒感染,来源于不同宿主的BFDV与宿主关系紧密,与地理分布没有明显的相关性.     

H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列测定方法的建立

建立以Sanger测序为基础的H9N2亚型禽流感病毒全基因组测序方法。从GenBank和GISAID数据库中选取2000至2012年中国地区和中国国家流感中心病毒序列数据库中H9N2亚型禽流感病毒的8个片段基因序列,通过比对分析在相对保守的区域设计分段扩增引物,共16对。选用1株病例分离毒株和4株环境分离毒株对引物进行验证和进一步优化。优化后的16对引物能够有效扩增5株H9N2亚型禽流感病毒,仅个别反应出现非特异扩增。所有获得的目的片段仍能有效进行后续测序实验。建立了一种能够有效获得新型重配H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列的Sanger测序方法,为该病原分子流行病学研究和开展风险评估提供技术支撑。     

一株柯萨奇病毒B组5型分离株V1641/YN/CHN/2016的全基因序列分析

对2016年云南省昆明市手足口病相关的柯萨奇病毒B组5型分离株V1641/YN/CHN/2016（简称V1641）全基因组进行测序,并分析其分子变异和进化特点。设计针对V1641的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增和测序,拼接获得的全基因组序列。利用MEGA7.0.26、Geneious9.1.4和SimPlot3.5.1软件分析全基因序列。V1641毒株基因组全长7 392nt,5’-UTR和3’-UTR分别长744nt和90nt,编码区长6 558nt,与其他CVB5相比未见核苷酸的插入和缺失,编码一个2 185aa的多聚蛋白。CVB5流行株大体上分为两个基因组,中国大陆流行株同原型株Faulkner一起分布于GenogroupⅠ分支,外国流行株大多分布于GenogroupⅡ分支。在GenBank中,V1641与KY303900-417/JS-CHN-2013最为同源,相似性为97.86%。V1641与其他中国大陆流行株的全基因组序列的核苷酸和氨基酸相似性分别为85.1%～97.8%和97.1%～99.6%。V1641在P1、P2和P3区段均与EV-B不同血清型的原型株聚类,经...     

九株猪圆环病毒Ⅱ型流行毒株全基因组克隆及序列分析

广西大学动物科技学院严业师、黄伟坚和屈素洁等科研工作者参考GenBank发表的猪圆环病毒Ⅱ型Porcine circovirus2,PCV2全基因组序列,设计一对引物,通过反向PCR技术扩增出9株PCV2流行株的全基因,并进行了序列测定与分析.     

1株人乳头瘤病毒6型山东地方株的全基因组序列分析

人乳头瘤病毒6型(Human papillomavirus type 6,HPV6)是引起生殖器疣与复发性喉乳头瘤的主要病原体之一.为明确2019年济南市1例尖锐湿疣患者的病毒基因组序列特征,本研究提取其尖锐湿疣组织标本总DNA,分两段进行HPV6全基因组PCR扩增和步移法Sanger测序,将拼接后的序列与全球36条不同来源的HPV6全基因组序列进行对比分析.结果 显示,1013/19/JN/CHN/HPV6株(以下简称1013/HPV6)基因组全长8031bp,属于变异谱系B1,与全球不同地区HPV6分离株序列的同源性为98.4％～99.9％.1013/HPV6株与B1亚谱系参考株AF092932全基因组序列相比具有19个核苷酸变异位点,分布在7个开放阅读框架(Open Reading Frames,ORFs)和非编码区内.本研究首次分析了分离自中国大陆的HPV6全基因序列特征,研究结果为HPV分子进化的进一步研究和分型诊断试剂的优化提供了数据.     

狂犬病病毒aG株全基因组序列测定及遗传稳定性分析

目的探究狂犬病病毒(Rabies virus,RV)aG株全基因组序列特征及遗传稳定性。方法严格按疫苗生产工艺进行传代,提取主种子批、工作种子批及疫苗原液病毒RNA,通过RT-PCR技术扩增全基因组各片段基因,然后分别将其克隆到p GEM-T载体中,并进行序列测定;采用DNAStar软件包对aG株与Gen Bank中4aGV参考株(JN234411)以及18株基因1型RV参考株进行同源性分析。结果 aG株全基因组由11 925个核苷酸组成,共编码3 600个氨基酸。疫苗原液与主种子批全基因组核苷酸和氨基酸同源性均为100%,而工作种子批与主种子批的核苷酸与氨基酸同源性分别为99.97%和99.92%;aG株与4aGV参考株全基因组核苷酸与推导的氨基酸同源性均为99.9%,其与18株基因1型参考株核苷酸与氨基酸序列同源性分别为84.2%~97.6%和93.7%~98.3%;aG株传代病毒与4aGV参考株全基因组氨基酸序列高度保守,且各主要功能区未发生变异。结论狂犬病病毒aG株在实验室长期生产传代过程中,全基因组遗传特性稳定。     

天津市致病毒性脑炎柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

肠道病毒是我国病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)的主要病原体。本文研究对4株引起VE的天津柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)分离株进行Illumina MiniSeq高通量测序,并对其全基因组特征、进化及重组特点进行分析。结果提示,4株CV-B5天津分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.5%~100.0%和98.1%~100.0%,与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为83.2%~96.5%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.4%。基于全基因组的系统进化分析将CV-B5流行株分为A-D四个基因型,其中天津与国内流行株均属于C基因型。C基因型进一步分为3个进化分支,而天津分离株处在两个不同的分支上。基于基因组各区段序列的系统进化与SimPlot重组分析结果显示,天津分离株15-39N、15-41N与埃可病毒30型(Echovirus 30,E-30)原型株在P3区3B、3C、3D区域均检测到重组信号。本研究有助于了解CV-B5的全基因组特点和重组规律,为相关疾病的防控提供依据。     

鹅圆环病毒浙江永康株全基因组的克隆及序列分析

为研究水禽流感大规模爆发的机理,进行了水禽流感病例中并发病原,特别是免疫抑制性病原的检测研究。根据已发表的鹅圆环病毒(Goosecircovirus,GoCV)序列,设计了一对检测引物,对浙江永康禽流感病死鹅样品进行PCR扩增,获得与预期552bp大小相符的DNA片段,经测序确认为GoCV特异序列,推测样品中存在GoCV。根据测定的序列进一步设计反向扩增引物,经扩增、测序、拼接后获得GoCV全长基因组序列。基因组序列分析表明,浙江永康株GoCV_yk01全长1821bp,具有圆环病毒共同的与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等特征,它与德国、中国台湾发表的序列在全基因组水平有91%～93%的同源性,在Rep和外壳蛋白的氨基酸水平有94%～97%的同源性。应用ClustalW方法作进化树分析显示,GoCV_yk01序列与德国株及中国台湾株均不在同一分支。圆环病毒可以感染淋巴细胞等增殖快的细胞,引起免疫抑制,从而造成其他病原的并发和继发感染,怀疑GoCV可能在2004年初永康爆发的鹅流感中起到了一定的协同作用。该GoCV_yk01是中国内地首次检测确认并测定全基因组序列的鹅圆环病毒。     

新疆绵羊肺腺瘤病理学诊断与全基因组序列分析

为了完成新疆绵羊肺腺瘤病毒诊断及全基因组序列测定,本研究采用兽医临床病理学和组织病理学观察疑似患病羊,并提取病毒悬液进行透射电镜观察,从患病绵羊的肺脏组织中提取基因RNA反转录为cDNA。参照GenBank中外源性绵羊肺腺瘤病毒美国株基因序列(AF105220)设计六对引物,对病料样品进行RT-PCR扩增和测序分析。结果表明,"小推车试验"时有鼻液流出,显微镜下观察,患病羊的肺脏有大小不一的腺瘤灶,且肺泡上皮细胞呈乳头状增生,肺泡腔内充满巨噬细胞,病灶中央的细胞核溶解。透射电镜观察到病毒颗粒直径大小约为88nm~125.4nm。RT-PCR扩增病毒基因组片段,获得完整的基因组序列全长7 456bp。与美国代表株(AF105220)和英国代表株(AF357971)BLAST在线比对核苷酸同源性结果分别为96%和95%,与内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)内蒙株(DQ838493)和美国株(EF680300)的核苷酸同源性分别为89.8%和89.9%。获得的全基因组序列的TM区的氨基酸序列中具有外源性绵羊肺腺瘤病毒(exJSRV)特有的致病性"YXXM"序列。说明此基因序列具有致瘤作用,这是我国新疆首次报道的外源性绵羊肺腺瘤病毒的全基因组序列,为更深入的研究新疆绵羊肺腺瘤病毒的生物学特性和致病机理奠定基础。     

西安市4起急性胃肠炎疫情中诺如病毒的分子特征分析

诺如病毒（Norovirus,NoV）属于杯状病毒科诺如病毒属,能造成急性肠胃炎暴发,在全球流行广泛,但其在西安市的流行情况不明。为明确2018年10月西安市4起幼儿园急性肠胃炎疫情的病原及其基因特征,本研究采集了患者肛拭子,用实时定量PCR检出诺如病毒阳性核酸,对其扩增部分多聚酶区和衣壳区基因并测序。将所得序列上传分型网站以明确基因型,并用软件分析系统进化、重组位点和正选择位点。共检出GII组阳性核酸31份,测序成功25份。4起疫情均由GII.2[P16]型诺如病毒引起。疫情株扩增序列全长、部分多聚酶区和衣壳区的序列与2018年美国流行株（MK773571）的核苷酸同源性分别为99.8%、99.5%和100%。疫情株与GII.2[P16]型中国参考序列（KY421122、KY806296和MG763377）的核苷酸同源性为99.6%,氨基酸同源性为100%。重组位点约在基因组的5 075bp。疫情株基因组的1 613～1 790aa没有正选择位点。及时的流行病学、分子流行病学研究和全基因组测序对控制诺如病毒相关疫情是必要的。     

猪圆环病毒2型三株贵州流行株全基因序列分析

为掌握贵州省猪圆环病毒2型(PCV2)流行株的分子生物学资料,对已分离的3株PCV2贵州流行株(GZ-LZ1株、GZ-KY1株和GZ-PX1株)进行全基因克隆与测序,应用生物信息学软件将贵州PCV2流行株与参考株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,3株PCV2贵州流行株贵州全基因组大小均为1 767 bp,同源性为97.0%-98.3%,与国内外24株参考株同源性为77.5%-99.9%,与国产疫苗株同源性为95.5%-98.2%;系统进化树结果显示,3株PCV2贵州流行株归属PCV2d分支,其中GZ-LZ1株和GZ-PX1株与国内PCV2疫苗YM-SH株的进化关系较远,而GZ-KY1与四川SC-10株、浙江ZJ-38株和黑龙江HLJ-10株的进化关系较近。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

鸽新城疫病毒BJ-C分离株基因组测序及系统发育分析

【背景】鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type Ⅰ,PPMV-1)感染引起的危害最严重的疫病之一,至今尚无有效的防控制剂。【目的】分析鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组信息及系统发育关系,为鸽新城疫的防控提供科学依据。【方法】设计首尾重叠的6对特异性引物,利用分段扩增的方法,以鸽新城疫病毒BJ-C株基因组cDNA为模板,分别扩增、测序后进行全基因组序列拼接。以NCBI数据库中发布的新城疫病毒序列为参考,针对鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组、F基因建立系统发育树。【结果】鸽新城疫病毒BJ-C株的基因组全长为15192nt。基于全基因组的系统发育分析发现其与PPMV-1/BJ-01/CH株的系统发育关系最近,核苷酸相似性为99.96%,氨基酸相似性高达100%,属于同一个分支,而与LaSota疫苗株等其他新城疫毒株的亲缘关系相对较远。基于F基因序列的系统发育树分析发现BJ-C株F基因与我国的BJP2013株同属一个分支。ClassⅡ类Ⅵ亚型F基因高变区序列(47-420nt)比对结果显示,安徽株Pigeon/Anhui/2369/2012、广东株Pigeon/Guangdong/GZ288/2013、北京株BJP13、浙江株Pigeon/Zhejiang/2036/2012及比利时株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011等与BJ-C毒株处于同一个分支,同属Ⅵb亚型。【结论】本研究获得了鸽新城疫病毒BJ-C株全基因组序列,分析了其系统发育关系,确定其属于ClassⅡ类Ⅵb型,为后续防控产品的开发提供了理论依据。     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。