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用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCRl 和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA 重组体的载体和限制性内切酶的底物。 相似文献
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齐义鹏 《生物化学与生物物理进展》1985,12(1):57-59
质粒的研究在遗传工程上占有重要地位。其分离纯化是一项费工费时和得率甚微的工作。一般常用的方法有制备性电泳,平衡等密度超离心和速度区带超离心等,这些方法各有特点,作者对它们进行了比较。质粒DDNA从苏芸金杆菌(Bacillus thuri-ngiensis)变种 isvaelensis 4Q_2-22和变种 相似文献
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分离纯化质粒DNA,在遗传工程和质粒的
分子遗传学研究中是重要的一环。分离和制备
质粒DNA的方法很多,有:澳化乙锭密度梯度
祛[2-5]、两相法[6]、酸酚法[7][碱变性法[8]p、甲基化
白蛋白(MAK)柱层析法[9]硝酸纤维素法[10]、电
泳法[11]等,这些方法都各有所长。根据质粒的超
卷曲结构、开环结构和线状结构的不同,各个质
粒分子量大小的不同,以及质粒DNA与RNA
和染色体DNA在电泳中迁移率的不同,在我
们实验室的条件下,研制了一种琼脂糖凝胶电
泳分离纯化和制备质粒DNA装置。运用这种
装置,纯化制备了以下质粒: pBR322, pASI,
pUB110、F}lac+proA+B+, pVA517A, pVA517B,
pVA517C, pVA517D, pVA517E, pVA517F,
pVA517G和pVA517H。并且对它们进行了电
镜观察,对其中纯化过的pBR322和pASI质粒
进行了转化实验,证明它们有生物活性。同时,
应用这种装置,可以一次分离具有不同分子量
大小的几种质粒,回收率约为85多。结果表明,
这种装置结构简单,操作方便,是纯化制备质粒
DNA的一种可用工具。 相似文献
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将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质粒pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K12HB101(recA~-r(?)m(?))为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质粒。利用环丝氨酸浓缩Ap~rTc~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120株无性繁殖系为Ap~rTc~s。随机挑出3株含有重组质粒的无性繁殖系进行大肠杆菌素El(colicin El)免疫特性测定及显微镜观察,证明为大肠杆菌素El敏感,并为典型的大肠杆菌形态。随机挑出一株含有重组质粒pAG-5的无性繁殖系,采用Zasloff等酸酚法进行重组质粒DNA提取,用Hind Ⅲ消化重组质粒DNA后进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察到重组质粒pAG-5除pBR322质粒DNA带外含有λ-Hind Ⅲ的第5 DNA带。用重组质粒DNA再次对HB101(recA~-r(?)m(?))及K12 802(Su_(11)~+m_K~+)受体进行转化,转化体在含氨苄青霉素培养基平皿上生长,但在含四环素培养基平皿上不生长,再次证明为Ap~rTc~5.每微克重组质粒DNA Ap~r转化体为4.0—4.6×10~3。 相似文献
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为了快速鉴定重组质粒DNA, Birnboim等
人[1]建立了快速碱性抽提法。在此基础上,我
们作了某些修改,不仅较有效地防止了质粒
DNA变性形式的出现,而且可以用来大量抽提
质粒DNA。若再协同轻基磷灰石柱层析121和酸
酚法[6]处理,可获得纯度较高的质粒DNA。我
们用修改法提取了分子量从2.6X10[6]-26X10[6]
道尔顿的4种不同质粒DNA,均收到了比较理
想的结果,特别对于难于抽提的或大质粒DNA
更为有效。 相似文献
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噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽 相似文献
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简便、快速检测质粒DNA的方法,无论是
在筛选、鉴定新质粒或重组质粒的研究中都具有重要的意义。我们在将质粒pBR 322 DNA与
A DNA进行体外重组、筛选和鉴定重组子过程
中,摸索了一种简便快速检测质粒及重组质粒
DNA的方法。此法对菌体和溶菌产物不需任
何处理,比较简便易行 相似文献
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我们在生物化学与分子生物学实验教学中开设了质粒 DNA制备及酶切鉴定实验。鉴于本科生实验单元时间短 (4学时 ) ,用常规的 Brinboim和 Doly方法进行质粒 DNA的制备往往不能在规定学时内完成实验。因此 ,我们对原有的实验方法 ,略加改进 ,采用高离子浓度中性盐一步沉淀质粒 DNA,制备出高纯度、高产率的质粒 DNA样品。1 材料与方法1.1 材料 p UC19重组质粒为本室构建 (内插入一约为 1kb大小的片段 ) ;LB培养基 ;溶液 (含 5 0 mmol葡萄糖 ,10 mmol EDTA,2 5 mmol Tris- HCl,p H8.0 ) ;溶液 (含新鲜配制 0 .2 N Na OH及 1%… 相似文献
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近年来随着遗传工程的飞速发展,DNA重组技术被广泛应用,许多实验室在制备一定纯度、产量较高、方法简便的质粒DNA方面作了许多工作。国外大多数实验室普遍采用CsCl等密度梯度超离心法,但国内受仪器限制,应用较少。我们比较了PEG沉淀质粒DNA, 羟基磷灰石法制备质粒DNA,快速抽提质粒DNA,以及M.A.K柱制备质粒DNA等方法,它们都各有利弊。本实验室对L.P.Elwell的实验条件稍作改进,温和地制备清亮裂解液并抽提质粒DNA,然后应用Sephacryl S-1000作凝胶过滤,获得了纯度高、产量大,无染色体DNA 相似文献
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枯草芽孢杆菌(Bacollus subtilis)温和噬菌体已广泛用于转导、转染、分子生物学和基因克隆等研究,但是它的分离和纯化尚有一定的困难。原因在于:1.和烈性噬菌体不同,高 相似文献
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到目前为止,所发现的细菌和放线菌的质粒DNA都是共价闭合超盘旋的环状结构。它的碱基组成与染色体DNA不同,分子量较染色体DNA小得多,有的质粒可以通过接合作用有效地转移到受体细胞中去。常利用质粒的这些特性来分离它们。现将几种分离质粒的方法介绍如下。 相似文献
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本文介绍一个从噬菌体T4诱导的大肠杆菌中纯化DNA连接酶的简法。这是从同一起始原料(噬菌体T4感染的大肠杆菌菌体)同时提纯三种酶(多核苷酸激酶,DNA连接酶及RNA连接酶)的步骤的一部分。这个方法包括以下几步:超声破碎菌体,抽提粗酶,用硫酸链霉素沉淀去除多核苷酸激酶和DNA.甩I)EAE纤素素(DE-52)柱层折将DNA建接酶与RNA连接酶分离开来,用磷酸纤维素(P-II)分步冼脱DNA连接酶,对在Tris-HCI,pH7.6中含50%甘油的缓冲液透析加以浓缩。最终得到高浓度(5500单位/毫升)和高纯度酶制品。 相似文献
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