水-有机溶剂两相体系中甲基单孢菌Z201细胞催化丙烯环氧化的初步研究

Laabe于1987年提出了生物催化剂工程(Biocatalyst engineering)和介质工程(Medium engineering)的概念^[1]。有机相生物催化中溶剂的选择也是介质工程的内容之一。纯酶在有机相中的催化作用已有大量报道^[2],但对完整细胞研究甚步。本文以甲基单胞菌(Methylomonas Z201)完整细胞为生物催化剂．丙烯环氧化为指标反应．研究有机溶剂对活性的影响并对催化活性——溶剂疏水性进行了相关性分析。研究了水一十六烷两相体系中十六烷含量和搅拌速度对丙烯环氧化速度的影响和细胞的操作稳定性。     

甲烷氧化细菌的一个新种

从沼气发酵装置中,分离出一株H型专性甲烷氧化细菌81Z菌株。它具有甲烷氧化细菌的一般典型性状。根据其极生单鞭毛和过氧化氢酶阴性的特征,该菌株明显地区别于已知的任何一种甲烷氧化细菌,被认为是一个新种并命名为沼气甲基弯菌(Methylosinus methanica)。本文还讨论了它在厌氧条件下的生命活动。     

类核环形结构在耐辐射球菌电离辐射抗性中不起主要作用

近来基于透射电子显微镜研究的论点“耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans) R1类核致密的环形结构是其极端辐射抗性的关键因素”已引起广泛争议. 本文在以前研究基础上系统地比较了野生型R1菌株、pprI (DR0167)基因突变株YR1及pprI基因功能补偿株在电离辐射前后的类核结构的形态差异. 荧光显微镜观察结果显示: (ⅰ) 具有超强电离辐射抗性的野生型菌株R1细胞类核主要呈现紧凑的环形结构, 而同样有环形类核结构的pprI突变株YR1细胞却对辐射非常敏感; (ⅱ) 2个pprI基因功能补偿株, YR1001(pprI全基因功能补偿株)类核绝大多数呈现絮乱松散的不规则形态, YR1002(pprI部分基因功能补偿株)呈现约60%左右的环形类核结构, 这两个菌株都具有与野生型R1同样的电离辐射抗性; (ⅲ) 另一pprI部分基因功能补偿株YR1004 (敲除pprI基因3′端333个碱基对)对电离辐射极其敏感, 其约60%左右的细胞含有环形的类核结构. 上述结果表明, 耐辐射球菌类核的环形结构在辐射极端抗性中不起主要作用.     

水-有机溶剂两相体系中甲基单胞菌Z201催化丙烯环氧化的初步研究

Lanne于1987年提出了生物催化剂工程（Biocatalyst engimeering）和介质工程（Medium enineering）的概念^[1].有机相生物催化中溶剂的选择也是介质工程的内容之一。纯酶在有机相中的催化作用已有大量报道^[2],但对完整细胞研究甚少。本文以甲基单胞菌（Methylomonos）Z201完整细胞为生物催化剂,丙烯环氧化为指标反应,研究有机溶剂对活性的影响并对催化活性-溶剂疏水性进行了相关性分析。研究了水-十六烷两相体系中十六烷含量和搅拦速度对丙烯环氧化速度的影响和细胞的操作稳定性。     

自沼气池中分离的一株甲烷利用菌

自沼气池中分离到一株甲烷利用菌,其主要生理特性是利用甲烷或甲醇作碳源和能源,生活史中具有休眠体,形成固氮菌型的孢囊,在利用甲烷的生长中不被乙酸盐、苹果酸、琥珀酸盐抑制,应是甲基杆菌属(Methylobacter)中的一新种,定名为淡橙黄色甲烷氧化杆菌(Mcthylo-batter luteolo-croceus sp. Nov.)。     

耐高渗透压酵母产生甘油及阿拉伯糖醇的研究IV．耐高渗透压酵母的糖代谢途径

1．测定了两株耐高渗透压酵母(Hansenula arabitolgenes Fang．275及 Zygosaacharo-myces cheyalieri Guill．2．309)无细胞提取液中EMP 及磷酸戊糖循环的酶活力,除在2．309中未能测出磷酸果糖激酶外,其他所测备酶在两株酵母中均有活力。 2．在两株酵母中均有联系NADP的多元醇脱氢酶,催化二攫丙酮还原为甘油(275厦2．309中)以及D-核酮糖还原为D一阿拉伯糖醇(仅在275中)。 3．用葡萄糖-C14的呼吸实赊表明在275号酵母中磷酸戊糖循环占较大比重,这与它能产生大量五碳化合物——阿拉伯糖醇是相符的。     

从豆制品废水厌氧发酵液分离的一株新的产甲烷球菌

用Hungate厌氧技术,从豆制品废水厌氧发酵液中分离到一株细胞直径为0.5--1.2μm的球形产甲烷细菌,编号8508。该菌株利用H2／CO2和甲酸盐生长产甲烷。生长要求乙酸盐、酵母膏和酪素水解物。最佳生长要求0．5--1．0％的NaCl或MgCl20生长的最适温度为35℃,最适pH 7．0--7．3。DNA的G+C含量为41mol％。菌株8508可能是甲烷球菌属(Metha-nococcus)中的一个新种,但还要通过DNA杂交、荧光抗体等测定证实。     

丝状真菌表达分泌系统中受体菌的构建

黑曲霉糖化酶高产菌株T21经紫外诱变后, 通过酪蛋白平板和蛋白酶活性测定筛选出胞外酸性蛋白酶活力仅为原株076%的菌株A.nigerT21-201,其生长特性和产糖化酶活力与原株基本一致。利用原生质体PEG法将含有报告基因vhb的表达分泌质粒Pgt10-vhb通过与选择标记质粒的共转化导入此蛋白酶部分缺陷株及其原株T21,检测在蛋白酶缺陷株Aspergillus niger T21-201 和原株T21中VHb的分泌表达,结果表明在A.nigerT21-201中VHb表达水平显著高于原株,但Northern blot却显示在两菌株中^vnb基因的转录水平近似,由此证明酸性蛋白酶缺陷对保护外源蛋白产生了显著效果。      

斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501反硝化相关基因结构及功能分析

在A1501株的基因组上鉴定了4个反硝化相关的基因簇: nar, nir, nor和nos, 共40个基因, 基因的转录产物与其他种群中物质运输、基因调控以及还原酶类蛋白高度同源. nir, nor和nos基因簇在染色体上位置靠近, 与nar基因簇相隔较远. 与其他反硝化细菌比对的结果表明, A1501株中的40个反硝化基因组成了一套完整的反硝化催化系统. 在A1501株中, 该系统有以下特点: (ⅰ) nar基因簇中, narK基因只发现一个拷贝. (ⅱ) 在narK与narG之间有一个narM基因. (ⅲ) 在narX, narL基因的下游鉴定了两个基因dnrE和orf1, 其中dnrE基因是一个属于FNR家族的转录因子. (ⅳ) A1501株中nir基因有16个, 是所有已知反硝化细菌nir基因数量最多的. (ⅴ) 在A1501株中, 同时也是在假单胞杆菌属中首次报道norR基因. (ⅵ) nos基因簇相对保守, 无论在基因组成还是排列方式与参照的菌株都完全一致.     

三孢布拉氏霉生物合成β-胡萝卜素的研究──Ⅰ.三孢布拉氏霉负菌优良菌株SCB201的选育

采用紫外照射、亚硝基胍（NTG）和离子束综合诱变处理,获得一株三孢布拉氏霉菌负亩优良菌株SCB201。在优化了的培养条件下,它与三孢布拉氏霉菌正菌SCB200接合培养产β－胡萝卜素达到2g／1,较其亲株0．2g／1的水平提高了10倍。     

极端嗜盐菌16SrDNA的PCR扩增

四株嗜盐菌Haloarcula vallismortis(EM201)、Haloferax denitrificans(EM303)、A_5和B_2已通过一对特定引物用PCR技术从总DNA中扩增出各自的16SrDNA片段,分子大小在1.47kd左右.DNA杂交也表明这些PCR产物具有嗜盐菌的同源性.     

甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立

用直接克隆法将miniF-lacZ-attFn7-kan 片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）〖JP〗美国分离株（SeUS1）基因组的多角体蛋白基因框内,miniF是大肠杆菌F因子复制子,携带miniF的重组病毒能够在大肠杆菌中低拷贝稳定复制,称为bacmid。由于SeUS1由不同的SeMNPV基因型组成,每个bacmid携带了一种病毒基因型,所有bacmid构成了SeUS1分离株的BAC文库。REN对111个bacmid分析表明,SeUS1分离株中除了包含具有完整SeMNPV遗传信息的基因型外,还包括不同类型的缺失基因型。将具有完整SeMNPV基因组的基因型SeBAC10转染昆虫细胞,可产生子代病毒,故SeBAC10是一种在真核细胞和原核细胞中均能复制的穿梭质粒。因为SeBAC10中多角体蛋白基因(Seph)被插入失活,将Seph作为报告基因通过位点特异性重组方式插入位于LacZ框内转座子Tn7的附着靶位点attTn7,得到重组SeBAC10 (即SeBAC10ph)转染甜菜夜蛾培养细胞Se301后,细胞出现典型的病理变化,核中出现多角体,证明SeMNPV BAC-TO-BAC外源基因表达载体系统构建成功。     

克鲁维酵母种间原生质体融合的研究

乳酸克鲁维酵母(Kluyueromyces lactis Y12—1)和脆壁克鲁维酵母(K.fragilis8554)是乳糖酶生产菌株。应用原生质体融合技术进行了两菌株种问融合的研究。通过试验．原生质体形成及再生的最佳条件为：对数期的细胞,2％的蜗牛酶．30℃酶解30分钟．原生质体形成率90％以上,再生率20%左右。原生质体融合由聚乙二醇(PEG)诱导。K.lactisY12-l不能旋酵菊糖;K.fragilis 8554不能同化D－松三糖和麦芽糖;利用二菌株自身的营养缺陷性质获得融合子。融合子既能发酵菊糖又能同化D－松三糖和麦芽糖;融合子的DNA含量约为二亲株之和;融合子的菌落形态与亲株相比有一定差别．在以乳糖为碳源的培养基中,融合子的乳糖酶产量提高14一l6％;连续15次传代,融合子稳定。     

一株甲烷氧化细菌的分离和某些特性

从利用天然气的蛋白生产菌“761”混合培养物中,分离到一株专性的甲烷氧化细菌Methylomonas sp·761M。通过对其形态学、细胞的细微结构、营养和生长特性等的研究,发现葡萄辅、铵盐和甲醇对其生长有明显抑制作用,蛋白胨和酵母膏有促进作用,而且此菌不同于文献已报道过的任何一个巳知的种。此外也讨论了甲烷氧化细菌的分离和培养方法。     

外源电子给体对甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性的影响

以丙烯氧化反应为指标研究了不同外源电子给体对甲烷细菌(Methylomonas sp．GYJ30)休止细胞催化活性的影响。结果表明甲烷、甲醇、甲醛和甲酸盐作为电子给体加入反应中,将甲烷单加氧酶催化丙烯环氧化反应活性分别提高5．3,12．7,10和12．4倍。以甲烷和甲醛作为外源电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶具有抑制作用;而以甲醇和甲酸盐作为电子给体时提高初始浓度对甲烷单加氧酶催化活性无明显抑制作用。研究了甲醇作为电子给体时它的代谢、环氧丙烷的积累以及催化反应活性与反应时间的关系     

非水体系中脂肪酶催化合成乳酸乙基糖苷酯的工艺研究

在非水体系中 ,通过固定化脂肪酶催化合成一种新型α 羟基酸衍生物 乳酸糖苷酯。考察了常压下有机溶剂、酰基供体、不同种固定化酶、乙基糖苷的浓度、酶量和反应温度对反应的影响。研究表明在无溶剂体系中以乳酸丁酯作为酰基供体可有效地合成乳酸糖苷酯 ,固定化酶Novozym435和来源于Candida sp .菌株的细胞固定化酶 ,化学修饰的干酶粉均是合适的催化剂。最佳反应条件为 :酶浓度 75g L ,乙基葡萄糖苷的浓度为 0.4mol L ,温度为 70℃ ,转速 200r min ,反应 50h ,转化率可达 71%。在真空度为 0.09MPa的压力下 ,反应温度 65℃ ,酶浓度 75g L ,乙基葡萄糖苷 0.35mol L时 ,反应初速率可达到 607(mmol·L^-1·h^-1 ) ,40h后转化率可达到 90%。反应产物经过萃取法和硅胶柱层析方法分离 ,纯度达到 95 % (W/W)。     

脱氧核酶抑制近日基因period 1表达的实验研究

研究脱氧核酶对近日钟基因period1(per1)表达的影响, 进而寻找治疗和近日节律有关疾病的基因疗法. 设计合成针对per 1的脱氧核酶DRz164, DRz256, 并构建pcDNA3-per1_164:256体外转录载体, 将转录产物和脱氧核酶混合, 在一定反应条件下进行体外切割反应, 地高辛酶联免疫及酶催化显色法检测脱氧核酶的体外切割效率. 将pcDNA3-per1和DRz164或DRz256在脂质体的介导下转染NIH3T3细胞, 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术(FCM)检测脱氧核酶对近日基因表达的影响. 于37℃孵育2 h后, DRz164对底物的剪切百分率为63%, DRz256为50.5%. RT-PCR半定量检测per1 mRNA表达水平明显下降, FCM结果显示细胞内Per1蛋白的合成受到抑制. 脱氧核酶DRz164, DRz256体外具有定点切割近日钟基因per1mRNA组分的活性, 使转染细胞per1 mRNA 和Per1蛋白表达下降.     

制备13β-乙基-3-甲氧基-8，14-开链-1，3，5(10)，9(11)-雌四烯-17β-醇-14-酮的微生物学研究

调查了10属酵母共104株形成一种光学活性的13β-乙基-3-甲氧基-8,14-开链-1,3,5(10),9(11)一雌四烯-17β-醇-14-酮的能力。发现酵母属酵母具较强的活性。啤酒酵母AS2.346是一株最好的菌,它能使底物几乎全部转化成产物。用这株菌研究了酵母细胞的培养和转化条件。在发酵过程中,观察到了“假结晶发酵”现象。在最适条件下,[葡萄糖4—4.5％和玉米浆2—2.5％,微酸性条件下培养的幼龄酵母细胞,转化pH中性,31屯并通气,乙醇浓度不高于3％(体积／体积)。]产物收率达85—90％。     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

椰毒假单胞菌的电镜观察

酵米面假单胞菌(Pseudomonas farinofermentans)系从食物中毒的变质酵米面中分离到的病原菌,它与揶毒假单胞菌(P.cocovenenans)为同种不同生物型,与洋葱假单胞菌(P.cepaia)有许多共同点。电镜观察表明,此3株假单胞菌在形态和结构上有以下共同特点：菌体呈短杆状,0．6-0．8×1．5—2．0μm。细胞壁由肽聚糖层和外膜(outer membrane)构成。有时可见丝状体(filaments) 甚至畸形细胞。无荚膜,无菌毛(pili)一端有多根鞭毛。细胞质内有电子透明的聚β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒。核区内有电子致密体(e|ectron-densebodies)或层状体(laminar bodies)。细胞表面可见到wei7细胞(mlncells)。均能产生细胞外“丝状物质”,这一特点尚未见报道。