甜瓜S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及白粉病诱导表达分析

为探讨S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因在甜瓜抵御白粉病菌中的作用,根据已知EST序列和甜瓜基因组数据库,在甜瓜抗白粉病品种‘Yuntian930’中克隆获得该基因的全长编码序列,命名为CmSAMDC(GenBank登录号为KF151861)。生物信息学分析表明,CmSAMDC的主开放阅读框(mORF)长1 095 bp,编码364个氨基酸,预测分子量为40 kDa。聚类分析表明,CmSAMDC预测蛋白与黄瓜和四季橘中该蛋白的同源关系最近,并与其他双子叶植物聚为一类。原核表达分析表明,CmSAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为40 kDa,与预测一致。实时定量表达分析表明,CmSAMDC基因受白粉病诱导表达,在接种后48 h表达量达到峰值,为接种前的7倍,并且在甜瓜的根、茎、叶、卷须中均有表达。结果提示该基因可能参与了甜瓜的抗白粉病反应。     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属。序列分析表明,GCRVS2片段长为3877核苷酸,编码一个分子量为138kDa的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质。为进一步了解该病毒RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV—RdRp)保守区(约1．5kb)重组质粒pR／RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的pR／RRpN及pR／RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达。筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白。Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV—VP2血清呈阳性反应。通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90％纯的目的蛋白。上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据。     

草鱼呼肠孤病毒RNA聚合酶基因的表达与产物纯化

草鱼呼肠孤病毒是引起草鱼出血病的主要病原,隶属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属.序列分析表明,GCRV S2 片段长为3 877核苷酸,编码一个分子量为138kDa 的蛋白VP2,具有RNA聚合酶性质.为进一步了解该病毒 RNA聚合酶特性,本研究在对GCRV RNA聚合酶基因(GCRV-RdRp)保守区(约1.5kb)重组质粒pR/RRp高效表达的基础上,分别构建了编码GCRV RNA聚合酶保守区N端与C端部分基因的 pR/RRpN及pR/RRpC重组表达载体,并在原核细胞中获得成功表达.筛选的重组表达菌株经IPTG诱导培养,得到分子量分别为98kDa、103kDa的目的表达融合蛋白.Western blot分析表明,该表达产物与兔抗GCRV-VP2血清呈阳性反应.通过ProBond柱亲和层析,纯化了融合有6个组氨酸的重组表达产物,并获得约90%纯的目的蛋白.上述结果为GCRV RNA聚合酶特性分析提供了依据.     

薇甘菊乙醇酸氧化酶基因的克隆、序列分析和原核表达

利用SSH和RACE相结合的方法获得了薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长,并对该序列进行了生物信息学分析。随后将该基因的cDNA编码区克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒,转化到大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中进行表达。序列分析表明,薇甘菊乙醇酸氧化酶基因cDNA全长1 363 bp,编码369个氨基酸,命名为MmGO（GenBank登录号EU716626）,推测的MmGO分子量为40.32 kDa,等电点为8.99。系统进化分析表明,MmGO与芸苔的GO序列亲缘关系比较近。将该基因重组到pET-32a(+)中进行原核表达,经0.1 mmol·L^-1 IPTG,25℃诱导4 h,获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His MmGO,Western-blot证实表达的6×His-MmGO能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为60 kDa,与预测的融合蛋白6×His-MmGO分子量相符。为进一步研究融合蛋白6×His-MmGO的活性和功能奠定了基础。     

3种外源诱导剂预处理对甜瓜抗病特征及其Fom 2和CHT基因表达的影响

该研究选用水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、Ca~(2+)、无菌水(对照)作为外源预处理诱导剂,以抗、感枯萎病甜瓜品种为材料,分别于诱导预处理2d后接种甜瓜枯萎菌,并于接种5、7、9d时观察发病情况,进行病情调查;在接种后1、3、5、7、9d取甜瓜叶片,分析抗病甜瓜(MR-1)和感病甜瓜(M1-15)叶片中甜瓜抗枯萎病基因(Fom-2)、几丁质酶基因(CHT)的表达变化,以探寻提高防治甜瓜枯萎病菌侵染的技术途径。结果显示:(1)外源MeJA和SA预处理接种后2品种的病情指数显著低于对照,但Ca~(2+)处理后的病情指数与对照无显著差异。(2)经外源诱导预处理接种后,MR-1和M1-15品种叶片的Fom-2和CHT基因均出现差异表达,但Ca~(2+)诱导其上调表达的效果微弱。(3)经SA、MeJA诱导预处理接种后,2品种叶片的Fom-2和CHT基因表达总体均显著高于对照;Fom-2基因的表达抗病甜瓜MR-1分别在接种后5d、7d时达到峰值,而感病甜瓜M1-15则均在接种9d时达到峰值;CHT基因的表达抗病甜瓜MR-1则均在接种后7d时达到峰值,而感病甜瓜M1-15分别在接种后7d、9d时达到峰值。(4)Ca~(2+)处理对抗、感甜瓜叶片的Fom-2和CHT基因的表达均无显著影响。(5)相关分析表明,经SA、MeJA诱导预处理接种后,甜瓜枯萎病病情指数与Fom-2和CHT基因表达量有显著的相关性;而Ca~(2+)处理效果不显著。研究表明:SA、MeJA通过诱导Fom-2、CHT基因上调表达,进而使甜瓜的抗病性提高,而Ca~(2+)处理对两基因表达和甜瓜抗病性均无显著影响。     

西伯利亚鲟致病性嗜水气单胞菌外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)法提取西伯利亚鲟嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白,电泳显示所提取的主要外膜蛋白分子量为26～120 kDa;为比较该菌株与气单胞菌菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以致病性豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)和无致病力的嗜水气单胞菌为对照,电泳图谱显示4种气单胞菌外膜蛋白的分子量主要集中在26～120 kDa之间;利用抗西伯利亚鲟嗜水气单胞菌血清的免疫印迹试验表明该菌株外膜蛋白中分子量为75 kDa、52 kDa、43 kDa、40 kDa、34 kDa、28 kDa的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种气单胞菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为28 kDa、34 kDa的反应条带为4株菌共有;43 kDa与75 kDa反应条带为部分菌株共有.为进一步筛选和研究致病性气单胞菌的共同保护抗原提供参考.     

白粉病胁迫下甜瓜叶片Hsp70差异表达分析

目的:研究甜瓜叶片Hsp70基因在白粉病胁迫下的表达差异。方法:采用对白粉病抗性不同的2个甜瓜品种,Trizol法提取叶片总RNA,PCR技术克隆Hsp70基因核心片段,采用Semi-Q-RT-PCR技术,以Actin基因为内参基因,对白粉病胁迫下不同处理、不同品种的甜瓜叶片Hsp70基因的表达进行差异分析。结果:抗病品种MR-1与感病品种伽师瓜叶片中的Hsp70基因表达量均随着接种时间的延长逐渐减少,但MR-1接种白粉病1d后表达量稍有增加;且伽师瓜中Hsp70基因的表达差异较MR-1明显。结论:两种甜瓜叶片感染白粉病后,Hsp70表达量均减少。     

丙型肝炎病毒结构蛋白E1在昆虫细胞中的表达及定位

本文在大肠杆菌中表达了与GST融合无跨膜区的丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)E1蛋白,并通过免疫兔制备了兔抗E1的抗血清。然后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有HCV结构蛋白E1基因的重组杆状病毒vAcHCVE1。通过Western blot分析,E1蛋白在Sf9细胞中表达分子量大小为30kDa大于预测的20kDa,表明存在翻译后修饰如糖基化等。通过Confocal显微镜观察当感染48h后E1蛋白定位在细胞质和细胞膜上。     

转甜瓜CmSAMDC基因拟南芥的获得及其耐盐性研究

该研究以哥伦比亚生态型野生拟南芥为材料,将甜瓜CmSAMDC基因构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304上,采用农杆菌介导法转入拟南芥,在含有50mg/L潮霉素(Hyg)MS固体培养基上筛选转基因后代,并利用T3代转基因幼苗进行耐盐性分析。结果显示:(1)成功构建了植物超表达载体35S∷CmSAMDC,并经农杆菌介导法转化拟南芥,潮霉素抗性筛选后获得了转CmSAMDC基因拟南芥T3代植株。(2)转CmSAMDC基因拟南芥T3代幼苗在含100、150、200mmol/L NaCl培养基中,侧根长势比野生型植株更为健壮;在200mmol/L NaCl浇灌处理后,转CmSAMDC基因T3代植株仍能维持正常生长,而野生型植株的生长明显受到抑制;在400mmol/L NaCl浇灌处理后16d,野生型植株逐渐死亡,而转基因植株仍能继续存活;对盐胁迫后植株的脂质过氧化程度(MDA)测定显示,野生型植株MDA水平较转基因植株上升更为明显。研究表明,过表达甜瓜CmSAMDC基因增强了转基因拟南芥的耐盐性。     

棉铃虫核型多角体病毒ORF33基因的原核表达和在宿主细胞中亚细胞定位

对棉铃虫Helicoverpa ar migera核型多角体病毒HearSNPV的ORF33基因(ha33)进行克隆和原核表达,hass在E.coli中表达不完全,表达产物的大小为17kDa,小于预测的分子量28.4kDa。用纯化的原核表达产物免疫家兔,制备了多克隆抗体,应用多克隆抗体检测了HearSNPV感染的宿主细胞(HzAMI)中ORF33基因的表达,表达产物的分子量为31kDa。并通过共聚焦荧光显微镜方法,用多克隆抗体检测编码的蛋白在宿主细胞(HzAM1)中的亚细胞定位,发现ha33编码的蛋白存在于宿主细胞的细胞质中,并持续到感染后期。     

丙型肝炎病毒结构蛋白E1在昆虫细胞中的表达及定位

本文在大肠杆菌中表达了与GST融合无跨膜区的丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)E1蛋白,并通过免疫兔制备了兔抗E1的抗血清.然后利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有HCV结构蛋白E1基因的重组杆状病毒vAcHCVE1.通过Western blot分析,E1蛋白在Sf9细胞中表达分子量大小为30kDa大于预测的20kDa,表明存在翻译后修饰如糖基化等.通过Confocal显微镜观察当感染48h后E1蛋白定位在细胞质和细胞膜上.     

野生华东葡萄脂类相关质体蛋白基因VpPAP1的克隆与表达

该研究以前期获得的葡萄cDNA全长文库为基础,采用RT-PCR技术克隆了中国野生华东葡萄‘白河-35-1’(Vitis pseudoreticulata‘Baihe-35-1’)相关质体蛋白基因,命名为VpPAP1(GenBank登录号JN624817)。序列分析表明,VpPAP1基因cDNA编码区全长为1 034bp,其中5′-UTR和3′-UTR区域分别为26bp和63bp,开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸,分子量为34 169.37Da,等电点为7.76。葡萄叶片接种白粉菌[Uncinula necator(Schw.)Burr.]后,运用实时定量PCR技术分析VpPAP1基因的表达模式,结果表明VpPAP1基因受白粉菌诱导表达,在接种后24h达到峰值。该研究为进一步研究中国野生葡萄脂类相关质体蛋白基因的表达及其在葡萄白粉病互作中的功能分析提供了依据。     

甜瓜抗霜霉病基因同源序列克隆与分析

采用RT—PCR扩增的方法,从高抗霜霉病甜瓜品种‘日本安农二号’中克隆到约3kb的cDNA片段（命名为MRGH-D,该基因是一个连续的通读编码框,编码1007个氨基酸。推测的蛋白质分子量为113．7kDa,等电点为7．88,蛋白质预测无跨膜区。根据推测的氨基酸序列,该基因属于TIR—NBS—LRR类抗病基因,具有TIR-NBS—LRR类抗病基因所有的保守结构域。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果显示,MRGH-J与甜瓜抗病基因的同源序列MRGHl2及抗霜霉病相关基因mp-19均具有高达99％的同源性,推测该基因可能在甜瓜抗霜霉病中起作用。     

烟夜蛾几丁质酶基因的克隆与表达

运用RT-PCR技术扩增编码烟夜蛾Helicoverpaassulta(Guen啨e)幼虫几丁质酶基因的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,获得该基因的成熟蛋白阅读框序列。将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T-2中,并转化入原核细胞中表达,序列测定结果表明,烟夜蛾幼虫几丁质酶基因的成熟蛋白阅读框全长1338bp,编码445个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为50.1kDa和9.26;推导的氨基酸序列与其近缘种棉铃虫几丁质酶氨基酸序列的一致性达99%,与其他6种昆虫几丁质酶的氨基酸序列也高度一致(65%~76%),并具有几丁质酶的典型特征。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上并转化BL21,SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导,76kDa附近没有特异蛋白条带出现,表明烟夜蛾几丁质酶基因不能在原核表达载体pGEX-4T-2中表达。     

茶树花粉特异蛋白基因CsPSP1的分离及序列分析

利用cDNA-AFLP技术比较了茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze cv.Wulong]花蕾发育早期和晚期的基因表达,结果表明存在明显差异。以E12和M20为引物对在晚期发育花蕾中筛选出一条281 bp特异表达的差异条带TDF53(transcipt-derived-fragment,TDF)。RT-PCR分析表明该片段只在晚期发育花蕾中特异表达。用RACE方法延伸其末端序列,克隆并测序获得全长cDNA序列(GenBank登录号:DQ887753)。该基因全长2079 bp,开放阅读框1701 bp,编码567个氨基酸,其分子量为63 kDa。序列和结构的同源性分析表明:该基因编码的氨基酸序列与烟草、油菜的花粉特异蛋白等同源性较高,由此推定,该基因为编码茶树花粉特异蛋白的基因,并将分离到的花粉特异蛋白基因命名为CsPSP1。     

小麦类Mla基因的分离与特征分析

根据大麦MLa基因的保守区域设计了4对家族性引物。通过用家族性引物对小麦(Triticum aestivum L.)抗白粉病品系TAM104R在接种和未接种两种条件下的基因差异表达进行RT-PCR分析,获得了一个在接种条件下特异表达的基因片段RJ-3-3L, 并用RACE方法获得了其cDNA全长,命名为TaMla1。序列比对显示: TaMla1与大麦MLa位点的基因家族成员具有高度同源性,TaMla1编码的氨基酸功能基序扫描表明其为一个CC-NBS-LRR型抗病蛋白。用一套中国春缺-四体材料将TaMla1定位到了小麦的1A染色体上,这正是大麦MLa基因位点在小麦中的同源区段所在的染色体。这些结果表明,TaMla1为一个类MLa抗白粉病基因。同时我们还获得了一个在不接种条件下特异表达的基因片段RW-2-3L,序列分析表明它与MLa 基因也高度同源,推测其可能是一个小麦白粉病的敏感基因或抗性负调控因子。     

金黄色葡萄球菌特异性PCR检测靶点的自动化筛选

从水母雪莲Saussurea medusa Maxim. cDNA文库中得到一段查尔酮合酶基因 (SmCHS) 片段,然后通过RT-PCR得到完整的查尔酮合酶基因cDNA。序列分析表明SmCHS全长1 313 bp,其开放阅读框为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为43 kDa。构建原核表达质粒pET28a(+)-SmCHS,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,表达的融合蛋白以部分可溶的形式存在。