细胞电拉伸方法的优化和阿霉素对白血病NB4细胞的硬度影响分析

研究表明,细胞的变形能力能够作为一个有效的生物标志,用来指示疾病的发展状况.由于细胞异质性的障碍,发现利用已报道的实验条件对新细胞进行电拉伸很困难.本论文中,一种基于介电泳-微流控的细胞电拉伸方法得到优化,并利用此优化方法进行了阿霉素对白血病NB4细胞硬度影响的调查.首先,用于细胞捕获的正向介电泳(pDEP)方法被优化和证实.结果指出,如果细胞缓冲液的电导率足够地低,低至细胞的截止频率能够出现,同时,电场的频率被调至高低截止频率范围之间时,细胞的pDEP效应容易实现.其次,系统地讨论了影响细胞变形量的三个参数.结果指出,细胞缓冲液的电导率低于细胞质的电导率是细胞电变形的先决条件,此外,增大电压或减小频率也能促使细胞变形.最后,借助优化的细胞电拉伸方法,调查了细胞机械特性和细胞功能变化之间的关系.结果表明,阿霉素使NB4细胞产生凋亡而变硬.总之,本文提出了一种新的细胞电拉伸方法,以便对细胞的变形能力进行简单有效的检测.     

骨骼肌细胞频响特性的数值分析

在100 Hz-100MHz频率范围内,利用非线性数值计算和曲线拟合分析,验证了蛙离体骨骼肌细胞的频率响应特性满足Cole-Cole公式(误差<3．45％),通过频域介电谱、 Cole-Cole图、介电损耗因子和介电损耗角正切频率谱的曲线拟合分析,确定了蛙骨骼肌细胞的 Cole-Cole参数:高频段相对介电常数εh=78,第一相对介电增量εt=113000,第二相对介电增量ε2=45000,第一特征频率fc1=9 KHz。第二特征频率fc2=158KHz,第一相位角β1=0．881,第二相位角β2=0．984,低频段电导率κ1=0．55mS／cm,A=35,m=1．08．     

50例兔在体和离体器官组织射频介电性能的测量与分析

根据同轴传输线反射原理,建立起计算机控制的生物组织介电测量系统;在６０—３０００ＭＨｚ频率范围对５０例兔器官组织进行了有效的在体和离体介电测量。测量结果的统计分析表明,不同兔器官组织之间介电参数的最大差异可达３０·４％;在体和离休测量得出的介电常数之间未见显著性差异,但电导率有频率依赖性的显著差异,因此将人体的离体介电参数延用到实际活体场合时,必须慎重。     

间断性低氧对大鼠腓肠肌介电性能的影响

目的：在40Hz～110MHz频率范围观察间断性低氧暴露4周大鼠离体腓肠肌细胞介电性能的改变。方法：采用低压氧舱建立模拟低氧模型,雄性SD大鼠随机分为间断低氧组和正常对照组。利用Agilent 4294A阻抗分析仪测量了离体大鼠腓肠肌的交流阻抗,通过频域介电谱、Cole—Cole图、介电损耗因子频谱、电导率虚部频谱和介电损耗角正切频谱的数据分析,观察间断性低氧暴露对大鼠离体腓肠肌细胞介电性能的影响。结果：间断性低氧暴露4周大鼠腓肠肌的介电常数（εL,εh）降低,介电增量△ε减小,绝缘性降低;低频电导率κL升高,高频电导率κh降低,电导率增量△κ降低;特征频率（f1,f2）增加;介电损失峰值ε”peak、电导率虚部峰值κ”peak和损耗角正切峰值婶谳均降低。结论：间断性低氧暴露致骨骼肌细胞介电性能降低,但其特征频率增加。     

金属离子及CTAB对酵母细胞介电行为的影响——相互作用的模型化解析

利用介电谱方法详细研究了Cu2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Al3＋、Ni2＋等金属离子以及阳离子表面活性剂CTAB：十六烷基三甲基溴化铵）对典型的真核细胞——酵母细胞介电性质的影响。在时间变化和浓度变化的情况下,对上述体系在40HZ～110MHz宽频范围进行了介电测量,Cole-Cole拟合确定了介电参数,定性讨论了不同试剂的时间和浓度的各种作用效果。通过无作用的对照细胞和有离子作用的作用组细胞10小时内的介电谱图比较发现,Cu2＋、Pb2＋及CTAB对酵母细胞介电行为的影响是以孵化时间依赖的方式发生;对有时间作用的三者选用不同的浓度进行作用,结果发现Cu2＋及CTAB对酵母细胞的作用同样是以浓度依赖的方式进行,而不同浓度的Pb”的作用效果接近。进一步,根据酵母细胞的结构特点采用双壳介电模型,理论计算了相参数,并结合细胞生理学知识对细胞受金属离子或特殊试剂作用后的相参数变化原因给予了解释;给出了金属离子,特别是Cu2＋以及CTAB与酵母细胞作用的可能机制。此外,模拟了实验条件下细胞悬浮液中各组成相参数对介电谱的依存关系,给出了一些有益的暗示：介电增量主要受细胞膜介电常数和细胞体积分数影响;特征频率尼与液泡膜介电常数以及细胞质的电导率等物理参数有关;而液泡内电导率支配高频的弛豫行为。这些模拟将对酵母细胞介电实时监测技术的实现提供基础参考。     

100 Hz ~ 100 MHz蛙骨骼肌介电谱的椭圆壳理论解析

在100Hz～100MHz频率范围内,应用浓厚系介电椭圆壳理论分析了蛙骨骼肌介电谱,提出了蛙骨骼肌细胞的椭圆壳模型参数。讨论了骨骼肌介电谱的高频段平行方向与垂直方向的电导率不相等的理论问题。明确了决定骨骼肌高频率段(10^6～10^8Hz)介电数据的物质基础主要是骨骼肌细胞内部的肌原纤维,其次是胞浆内的微小颗粒(线粒体、肌质网)。     

亚砷酸诱导分化的急性早幼粒细胞白血病细胞浸润人脑膜组织的体外模拟及其分子机制研究

目的:探讨急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)合并中枢神经系统白血病的发病机制。方法:采用流式细胞术检测亚砷酸(Arsenious acid, ATO)诱导分化前后的APL细胞及人APL细胞株NB4细胞表面CD56、CXCR4的表达;用荧光染料-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记ATO分化的APL(APL/ATO)、NB4细胞(NB4/ATO);用微重力旋转培养法体外模拟APL细胞浸润人脑膜组织,观察组织学及超微结构。结果:ATO诱导后,APL/ATO细胞表面CXCR4的表达明显高于诱导前(35.2±9.5%vs. 18.6±4.9%);NB4/ATO细胞表面CXCR4的表达明显高于诱导前(39.6±2.6%vs. 21.0±7.3%);APL/ATO细胞表面CD56的表达明显高于诱导前(36.6±8.9%vs. 25.8±5.15%);NB4/ATO细胞表面CD56的表达明显高于诱导前(44.6±8.4%vs. 25.6±2.4%)。组织学实验结果显示对照组脑膜组织未见NB4、APL细胞浸润,实验组可见APL/ATO、NB4/ATO细胞浸润到人脑膜组织中;荧光显微镜下可见被标记的APL/ATO、NB4/ATO细胞浸润到人脑膜组织中,扫描电镜见APL/ATO、NB4/ATO细胞浸润到脑膜组织中。结论:本研究采用微重力旋转培养系统体外模拟了ATO诱导分化的异常早幼粒细胞浸润人脑膜组织,APL细胞和NB4细胞CXCR4、CD56的表达升高可能是ATO诱导治疗APL所致的中枢神经系统浸润的分子机制之一。     

模拟高原低氧对小鼠红细胞介电特性的影响

目的：探讨模拟高原低氧对小鼠红细胞介电特性的影响。方法：实验动物分成平原对照组和模拟高原低氧组,采用Agilent 4294A阻抗分析仪测量小鼠红细胞交流阻抗,通过细胞介电谱、Cole-Cole图、介电损耗因子频谱、损耗角正切频谱以及Cole-Cole方程的曲线拟合分析,观察模拟高原低氧对红细胞介电特性影响。结果：小鼠模拟海拔5000 m低氧4周后,模拟高原组的低频介电常数εl和介电增量Δε较平原对照组分别增加57%和59%;模拟高原组的低频电导率κl和高频电导率κh较平原对照组分别降低49%和11%。结论：模拟高原低氧可以引起小鼠红细胞介电性增加和导电性降低。     

成骨细胞介电特性检测的方法研究

目的:以小鼠成骨细胞为材料,建立一套完整的用于成骨细胞的介电特性检测方法。方法:本研究首先是设计制作不同形状和尺寸的细胞介电谱检测装置(测量池),其次进行测量池的生物相容性评价,包括浸提液毒性实验,HE染色观察细胞形态。最后将细胞培养在测量池中,连入阻抗分析仪在20Hz~10MHz检测并联电导Gp和电容Cp并绘制介电谱图。结果:生物相容性检测表明测量池对细胞无毒性,可使用。此外,介电特性检测结果表明随着频率的增大,细胞的电容减小,电导略微增大后减小;随着培养时间的增长,电容值增大而电导值减小;经中强磁场处理后,细胞的电容和电导值都有下降。结论:该方法能够为其他贴壁细胞的介电特性检测提供研究基础,并对于在此基础上展开的贴壁细胞介电特性解析提供参考。     

PKM2在白血病NB4细胞系的分布及对c-Myc蛋白的影响

探讨PKM2在白血病NB4细胞中的分布情况及对c-Myc蛋白的影响。免疫荧光技术检测PKM2在NB4细胞中的分布情况。将含靶点序列的GV248载体、包装质粒Helper 1.0和Helper 2.0共转染293T细胞,包装慢病毒。收集病毒上清,浓缩纯化后感染NB4细胞,荧光显微镜观察感染效率,Western blotting检测PKM2和c-Myc蛋白的表达变化。CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果显示,PKM2在NB4细胞核及细胞质中均有表达,细胞核中比例较大。成功构建LV-PKM2-RNAi病毒,感染的细胞PKM2和c-Myc表达下调(p0.05),细胞增殖能力降低(p0.05)。这些结果表明PKM2主要分布在NB4细胞核,抑制PKM2表达可明显抑制NB4细胞增殖,并抑制c-Myc蛋白表达。     

生物组织电导率图像的热声重建

本文以微波热声效应为基础,报道了一种重建生物组织电导率相对分布图像的方法。和传统的微波热声像相比,重建得到的组织电导率图像消除了由于微波场能量密度分布不均匀带来的影响,能够准确的反映组织的介电特性差异,实现对肿瘤的早期发现。本文首先从理论上详细推导了获得生物组织电导率分布图像的原理,然后在实验中通过结合已有的脉冲微波成像系统,重建得到了一块肌肉组织的电导率分布图像。实验结果表明利用热声成像技术,组织的电导率分布图像能够被清晰的重建,本研究为推进热声成像技术的实用性打下了理论和实验基础。     

正交设计优化电转染CHO细胞的方法

目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:CHO-dhfr-细胞电转染的优化参数为低离子强度Tris-Cl缓冲液、750 V/cm、50μF、电击2次、间隔1 min,各因素对转染的影响大小依次为缓冲液、电场强度、脉冲次数、电容。结论:确定了电穿孔法转染CHO-dhfr-细胞的方法,为进一步应用该细胞株表达重组蛋白打下了基础。     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

ATRA诱导分化的NB4细胞浸润裸鼠肺组织模型的建立

目的:建立全反式维甲酸(ATRA)诱导分化的NB4细胞浸润裸鼠肺组织模型,为探讨诱导分化综合征(DS)的发生机制、预防和治疗提供研究平台。方法:首先,取对数生长期的NB4细胞在ATRA诱导下、在RPMI 1640培养基中、在37℃和5%CO2的条件下培养,72 h后收获诱导分化后的NB4细胞接种裸鼠尾静脉。然后,30天后处死裸鼠取肺组织,用G显带方法检测裸鼠肺组织的染色体核型,HE染色观察裸鼠肺组织学,电子显微镜观察超微结构,RT-PCR法和FISH技术检测裸鼠肺组织PM L-RARa m RNA转录本及PML-RARa基因的表达。结果:实验组染色体核型符合NB4细胞特征,在组织学和超微结构上明显见到分化的NB4细胞浸润裸鼠肺组织,检测到PM L-RARa m RNA转录本和PML/RARa融合基因;对照组未见到分化的NB4细胞浸润裸鼠肺组织,PML-RARa m RNA转录本和PML/RARa融合基因检测阴性。结论:用ATRA诱导分化的NB4细胞成功的建立了浸润裸鼠肺组织模型,为探讨诱导分化综合征(DS)的发生机制、预防和治疗提供了研究平台。     

胆固醇衍生物脂质体的物理稳定性和细胞相容性研究

目的：研究胆固醇衍生物（CTBBA）脂质体的物理稳定性,细胞相容性以及药物输送。方法：CTBBA组入脂质体并测定不同pH下的zeta电位。对长期保存的脂质体进行粒径分析和含磷量分析,评价脂质体的物理稳定性。通过测定包封在脂质体内的阿霉素的体外释放,来评价CTBBA对脂质体释放药物的影响。用MTT法检测CTBBA本身以及CTBBA脂质体的细胞相容性。评估了用流式细胞仪和荧光显微镜检测脂质体细胞内药物输送能力的可行性。结果：zeta电位数据表明CTBBA脂质体带有正电荷,可以改善脂质体在长期保存过程中的物理稳定性;作为胆固醇衍生物的CTBBA能有效的降低药物的渗漏;相比某些正电荷载体,CTBBA的细胞毒性较低;流式细胞仪在反映阿霉素脂质体的细胞定位上有局限,固定液的使用会改变阿霉素荧光的细胞内分布。结论：正电荷CTBBA脂质体具有改善脂质体长期保存稳定性,且细胞毒性低的特点。流式细胞仪不能完全反映载药的CTBBA脂质体在细胞内的分布。     

TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件优化

为确定氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的最优条件,首先通过单因素实验对影响藻细胞活性测定的TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂（乙醇）质量分数、培养时间、培养温度进行分析,选定各因素的变化范围,再利用正交试验设计方法,在藻细胞活性测定的最适培养温度下,对TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂质量分数、培养时间进行3水平优化试验。最后确定优化的TTC 脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件为TTC质量分数0.1%、缓冲液pH 8.0~8.5、乙醇质量分数60%、培养时间5 h、培养温度35 ℃。在此条件下所测藻细胞活性最高,为螺旋藻细胞活性的评价提供了一定参考。     

空间细胞电融合关键技术的地基研究——烟草细胞的电融合

本文针对建立空间细胞电融合技术存在的三个主要问题进行了研究。结果表明,用低温(4℃)、融合介质(0.55 mol/L甘露醇)并添加0.1%纤维素酶保存原生质体,72 h内可以使约94%细胞维持无壁状态,同时并未使细胞丧失再生能力,基本满足从地面制备亲本细胞到在微重力条件下进行电融合,对亲本细胞保持无壁状态的要求。为减少剪切力环境对亲本细胞造成的损伤,一方面用超速离心方法对亲本细胞之一去液泡,另一方面用电泳代替蠕动泵混合亲本细胞。而且,由于原生质体壁生长与其膜电位之间存在负相关性,因此利用电泳方法可以有效地富集和优化亲本细胞。根据地面实验结果推测,空间有/无液泡亲本细胞电融合的较适合参数可能为:交流电场强度90V/cm,频率0.8 MHz,排列时间20 s,直流脉冲1.0—1.3 kV/cm,幅宽40μs,两次脉冲。     

白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析

为了分析不同启动子在白血病细胞中驱动外源基因表达能力的差异,文章选择了4种含不同启动子EF1α、PGK、Ubiquitin和CMV驱动的GFP报告基因的慢病毒载体,用以感染4种不同的白血病细胞株——NB4、HL60、Kasumi和THP1,利用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR的方法检测其GFP表达效率,发现EF1α启动子驱动GFP表达的能力最强,CMV最弱,PGK和Ubiquitin则介于两者之间。该结果提示在白血病细胞中研究基因功能时,应根据不同的研究需求选择最为合适的启动子。     

NLS-RARα对人白血病细胞NB4分化抑制及其机制的研究

该文旨在探讨带核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal retinoic acid receptor alpha,NLS-RARα)对人急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞株NB4分化的影响及其机制。免疫印迹实验检测全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导的NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b和p38α蛋白质水平;利用慢病毒介导的NLS-RARα基因过表达,进一步用免疫印迹实验验证过表达效率并检测NLS-RARα对NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b和p38α蛋白质水平的影响;间接免疫荧光实验分析NLS-RARα与p38α的空间共定位;免疫共沉淀实验分析NLS-RARα与p38α的相互作用。结果显示,生理浓度和药理浓度的ATRA促进NB4细胞分化的同时也激活了p38α,且p38α的活性变化与髓系分化标志物C/EBPβ变化一致;髓系分化表面标志物CD11b表达量在药理浓度ATRA(1μmol/L)处理下达到最高;NLS-RARα抑制NB4细胞的分化,且只有在ATRA存在的条件下,NLS-RARα抑制NB4细胞的分化与下调p38α活性相关;NLSRARα与p38α存在空间共定位且NLS-RARα与p38α直接相互作用。该研究结果提示,当存在ATRA诱导时,NLS-RARα与p38α直接相互作用后下调p38α的活性进而抑制NB4细胞的分化。     

基底周期拉伸引起ECV-304细胞形态学变化的分析

对ECV-304细胞施以最大应变10％、0.67Hz的周期拉伸,利用计算机图像处理系统,对周期拉伸过程中ECV-304细胞的取向调整进行了形态学分析,结果显示：周期拉伸能引起细胞长轴取向垂直于最大主应变方向;加载12h内细胞长短径比增加,12-24h之间长短径比下降,随后趋于稳定;细胞在周期拉伸最大主应变方向上的最大截距缩短,而在垂直于最大主应变方向上的最大截距延长;取向调整的过程与长短径比增大的过程有显著的相关性。表明在周期拉伸过程中的取向调整是一个细胞具有方向差异性的变形过程,而不是刚性的旋转或位移。