巴卡亭ⅢC-10位乙酰基水解酶产生菌的筛选和鉴定

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ是合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前体.以巴卡亭Ⅲ为底物,结合TLC、HPLC、HPLC-MS分析方法,通过设计专门的筛选方法筛选产酶菌株,得到一株巴卡亭ⅢC-10位脱乙酰基酶产生菌株Z1-34.以形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析作为菌株的鉴定手段,Z1-34被鉴定为稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea),首次发现稻草假单胞菌产生巴卡亭ⅢC-10-脱乙酰酶.     

一株能水解巴卡亭ⅢC-10位乙酰基的成团泛菌的筛选和鉴定

10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ是合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前体。以巴卡亭Ⅲ为底物,结合TLC、HPLC、HPLC-MS分析方法,通过设计专门的筛选方法筛选产酶菌株,得到一株巴卡亭ⅢC-10位脱乙酰基酶产生菌株Z1-56。以形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析作为菌株的鉴定手段,Z1-56被鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans),首次发现成团泛菌产生巴卡亭ⅢC-10-脱乙酰酶。     

金顶侧耳化学成分的研究

对榆黄蘑的化学成分进行了研究,从子实体中分离和鉴定出D-甘露醇、麦角甾醇、1-癸醇、5-氧代-L-脯氨酸甲酯、5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氢化-1H,6H-联吡咯-[1,2-a;1,2-d]吡嗪、邻苯二甲酸二丁酯和环戊-1,2-二酮等物质。并采用高效薄层析和高效液相色谱两种方法证明了洛伐他汀在金顶侧耳中的存在。     

一种改良的分枝菌酸提取及其非放射性TLC检测方法

分枝菌酸(mycolic acid, MA)是存在于分枝杆菌细胞壁中的独特长链脂肪酸,与分枝杆菌(mycobacterium)抵御不利环境、耐受抗生素和逃避宿主免疫密切相关,是较热门的抗结核药物筛选的靶点。MA的检测方法主要有放射性薄层层析(thin-layer chromatography, TLC)和液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS),受放射性元素使用资质和标准品等的限制,MA分析是分枝杆菌相关研究的一个难点。本研究采用一种普通薄层层析技术,并对使用四丁基氢氧化铵溶液水解酯化的分枝菌酸,将其甲酯化后再用无水乙醚萃取分枝菌酸甲酯的操作步骤进行改良,使分枝杆菌的MA提取及分析可在常规生物实验室中开展。研究通过比较不同分枝杆菌及不同生长时期的MA成分与亚型特征、检测靶向分枝菌酸合成通路的抗结核药物对细菌MA合成影响以及分枝杆菌突变株对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb) H37Ra分枝菌酸合成影响等基础和应用研究的3个方面,进一步验证该方法在分枝杆菌MA分析中的实用性。结果表明该方法在不使用放射性元素和缺少标准品情况下可简便快速地分析MA及亚型特征,可广泛用于新型抗分枝杆菌药物筛选靶向分枝菌酸合成通路机制及基础研究中MA相关的分析和应用。     

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合...     

红豆杉内生真菌中巴卡亭Ⅲ产生菌的筛选及培养基的初步优化

目的:筛选出产巴卡亭Ⅲ的红豆杉内生真菌,为抗癌药物紫杉醇提供一个新的来源。方法:从云南红豆杉树皮中分离纯化出内生真菌,对其进行液体发酵培养,过滤,收集菌丝体并破碎,用二氯甲烷萃取,萃取液进行薄层层析,与巴卡亭Ⅲ标准品有相同比移值的样品再利用高效液型色谱与标样进行比照,进而筛选出产巴卡亭Ⅲ的内生真菌。同时以发酵培养基基础,对筛选出的真菌进行碳源和氮源的优化。并在此基础上探讨几种常见的紫杉烷类化合物代谢诱导剂乙酸钠、苯甲酸钠、苯丙氨酸和亮氨酸的浓度对巴卡亭Ⅲ积累的影响。结果:得到一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌NSZJ043,该菌株易培养,生长迅速,经鉴定属于曲霉属。NsZJ043产巴卡亭Ⅲ的培养条件的初步优化结果表明:最适碳源、氮源分别是蔗糖和蛋白胨;在含20g/L蔗糖、1．5g/L蛋白胨、0．1 mmol/L乙酸钠、0．01mmol/L苯甲酸钠的优化培养基中培养8d,巴卡亭Ⅲ含量为34．6μg/L。结论:筛选出一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌,其具有优良的发酵特性,巴卡亭Ⅲ前体物质苯甲酸钠和乙酸钠对巴卡亭Ⅲ的合成有促进作用;苯丙氨酸和亮氨酸对其含量影响不显著,优化后NSZJ043产巴卡亭Ⅲ含量有较大的提高。     

朱砂根愈伤组织诱导及其岩白菜素含量的测定

取朱砂根(Ardisia crenota Sims．)幼苗不同部位作外植体,研究不同激素组合对愈伤组织诱导的影响,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)检测愈伤组织中岩白菜素含量。实验结果表明朱砂根幼苗的不同部位(胚根、下胚轴、茎及叶)均能诱导出愈伤组织,最高诱导率都在45％以上,以MS基本培养基添加2,4—D0．5mg L^-1和KT0．01mg L^-1时愈伤组织的诱导和生长最好。这些愈伤组织均有合成岩白菜素的能力,其中以胚根诱导的愈伤组织中岩白菜素含量最高,为干重的0．076％,相当于原植物根中含量的1／9。高效液相色谱定量测定法精密度高,专一性好,能准确检测朱砂根愈伤组织中岩白菜素的含量。     

MSPD-HPLC法分析云南红豆杉中的10-DAB Ⅲ和紫杉醇

为建立云南红豆杉(Taxus yunnanensis)中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB Ⅲ)和紫杉醇(Taxol)的分析方法,该研究采用基质固相萃取-高效液相色谱分析(MSPD-HPLC)对云南红豆杉中的10-DAB Ⅲ及Taxol进行定量分析,探究硅胶、佛罗里硅土、酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝、C₁₈、C₁₈-ME、C₁₈-G1、C₁₈-HC、Diol、Xamide、Xion 共12种样品预处理分散剂及各种分散剂的质量、洗脱剂的种类、洗脱剂的浓度、洗脱剂体积对两种成分分析的影响,并对优化后的条件进行方法学验证,同时与超声提取、热回流提取预处理方法进行比较分析证明其有效性。结果表明:(1)12种固相分散剂中,碱性氧化铝具有良好的目标化合物萃取物检出量,并且当碱性氧化铝与样品的质量比为3:1、6 mL甲醇为洗脱剂洗脱时,10-DAB Ⅲ和Taxol的萃取检出量较高。(2)建立的云南红豆杉枝叶中10-DAB Ⅲ和Taxol的分析方法具有良好的线性关系(r≥0.999 9),10-DAB Ⅲ和Taxol的检出限和定量限分别介于0.023 9～0.030 1 μg·mL^-1和0.142～0.178 μg·mL^-1之间; 各目标分析物平均加样回收率在93.6%～109.0%之间。(3)比较分析显示,3种方法对2种紫杉烷类化合物的萃取检出量基本无差别,但MSPD法溶剂消耗少、操作简单,分析时间短,净化效率高,可应用于云南红豆杉原料的快速分析。该研究以碱性氧化铝为分散剂应用于云南红豆杉紫杉烷类化合物的萃取,建立了快速、高效的云南红豆杉中10-DAB Ⅲ和紫杉醇的分析方法,为云南红豆杉中的紫杉烷类化合物的定量分析提供了依据。     

SPE-HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量

针对红豆杉内生真菌发酵液中紫杉醇的含量测定进行探讨,以建立快速高效低耗的检测方法.采用C_(18)固相萃取柱对紫杉醇进行吸附,用不同浓度的甲醇-乙酸铵和甲醇分别作为洗脱剂对其进行洗脱,比较两者的洗脱效果,洗脱液用HPLC进行检测;色谱条件为:流动相甲醇(v):水(v):乙腈(v)=20: 45: 35,流速:0.70 ml/min,检测波长:227 nm.结果表明,浓度为80%的甲醇溶液洗脱效果较好,紫杉醇的回收率为87.6%.     

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI).重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8kD,与预期分子量相符.经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致.     

茴香醛比色法测定发酵液中海南霉素效价

海南霉素在加热条件下能与茴香醛浓硫酸浓液反应产生深蓝色物质,在一定浓度范围内海南霉素效价与颜色深浅程度呈线性关系。所以比色法可以测定发酵液中海南霉素效价。此法快速,简便,重现性好。     

聚醚类抗生素发酵液中残油含量的比色法检测

目的:建立油含量的化学检测方法,并对聚醚类抗生素发酵液中的残油含量进行检测。方法:油水解为脂肪酸后与Cu2 离子反应生成蓝色的油酸铜,用比色法检测油酸铜的量,并计算发酵液中残油的量。检测波长为715nm。结果:该方法的线性范围0.4~2.0mg/ml,回归系数为R2=0.9999,平均RSD为0.466%,回收率在96.88~102.33%之间,以油和水制成的指示管,平均相对误差为-0.17%。结论:该方法线性、重复性和回收率良好,检测灵敏度高,可作为聚醚类抗生素发酵过程中残油指标的检测。     

HPLC-ELSD法测定发酵液中L-鸟氨酸的含量

采用HPLC-ELSD法,Prevail C18柱,体积分数0.06%HFBA溶液-乙腈(88∶12)为流动相,柱温30℃,流速为0.8 ml.min-1,ELSD漂移管温度110℃,气体流量2.8 L.min-1,建立了测定L-鸟氨酸的方法。鸟氨酸在0.1-0.6 g.L-1范围内,线性回归比非常显著(r2=0.9998),平均回收率98.94%。该法简便、快速、准确性高、重复性好,适合于L-鸟氨酸的定量分析。     

Emulsification of Hydrocarbon Fermentation Broth by Surfactants

In order to perform hydrocarbon fermentation satisfactorily, it was necessary to get the sample representing the real feature of the broth. However, Corynebacterium hydrocarboclastus S10B1, which could accumulate a good deal of l-glutamic acid, formed a coagulated mass of cells like pellet as they grew up, making the broth heterogeneous, To obtain homogeneous broth, addition of some kinds of surfactants was examined. It was made clear that addition of higher alcohol ethers of polyoxyethylene having H.L.B. value of about 15 was effective and emulsified broth could be obtained. Thus time course studies could be performed in hydrocarbon fermentation.     

用浊度法测定发酵液中谷氨酸含量

大肠肝菌谷氨酸缺陷型只有在加有谷氨酸的培养基中才能生长,且其生长的细胞密度与谷氨酸加入量在一定浓度范围内是正相关,故可以用它作为指示菌来测定发酵液中谷氨酸的含量。     

重铬酸钾-DNS比色法测定发酵液中乙醇含量

发酵液中往往含有一些还原性物质,如葡萄糖等,用经典的重铬酸钾氧化比色法来测定发酵液中乙醇含量时,往往出现结果偏大的现象.为了测定发酵液中乙醇含量,在经典重铬酸钾氧化比色法基础上,使用DNS氧化比色法测定葡萄糖含量,修正乙醇含量的测定结果.统计分析发现,经改良的重铬酸钾-DNS比色法测定含葡萄糖的乙醇标准溶液时相对误差均值为0.95%,远小于传统的重铬酸钾氧化比色法的相对误差均值18.07%,在精密度相似情况下提高了准确度,更适宜用于测定含葡萄糖等还原性成分的发酵液中乙醇含量.     

肌苷发酵液絮凝除菌体的研究

目前国内肌苷生产厂家普遍采用的提取方法是“双柱法”,即先用阳离子柱吸附,然后再用炭柱吸附。该方法不但周期长,工作量大,能耗高,而且提取收率低,一般只有60％左右,使我国肌苷的生产成本大大提高。因此,寻求新的提取方法,降低生产成本,是肌苷生产厂家及有关科技人员所共同关注的问题。肌苷发酵液的除菌体就是新法提取的步骤之一,它可以省去阳离子吸附柱,直接采用炭柱吸附,采用此法可使提取周期大大缩短,降低能耗,提高提取收率。 肌苷菌体较难清除,本研究采用能耗低、易操作,工作量小的絮凝方法,所用的絮凝剂为天然无毒物质,因此沉淀菌体可用作饲料蛋白,起到一举两得的作用。     

冬虫夏草和蛹虫草发酵液抗菌活性研究

研究了冬虫夏草和蛹虫草发酵液的抑菌特性,结果表明:两种虫草的发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌均有较好的抑制作用,且对前两者的抗菌作用强于后两者;热稳定性试验表明发酵液中的抑菌物质具有较强的热稳定性;虫草发酵液与25%糖液和10%盐液协同作用可以增加对参试细菌的抑菌作用;对比试验得出蛹虫草发酵液的抑菌活性较冬虫夏草发酵液的抑菌活性强.     

高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法

透明质酸（HA）在保健品、化妆品及临床医疗等领域都具有重要应用,发酵法是HA生产的主要方法。发酵液中HA含量的快速、准确测定对于HA的生产具有重要意义。在原始十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法测量HA浓度的基础上,提出了去除HA与乙酸缓冲液混合后的水浴步骤、降低CTAB试剂浓度（2.5 g/L）以及确定HA-CTAB络合反应时间（5 min）的改良CTAB法。进一步研究了发酵液各成分对改良CTAB方法的干扰,结果表明,葡萄糖、阿拉伯糖、D 葡萄糖酸前体等对CTAB浊度法没有干扰,但Mg2+等具有较为明显的干扰。通过冰乙醇沉淀与改良CTAB浊度法的耦合,实现了发酵液中HA含量的高效测定。