大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

我们由E.coli AS1.76克隆了青霉素G酰化酶的基因,并且测定了其全部核苷酸序列。青霉素G酰化酶结构基因是由下述功能片段组成的:(1)编码信号肽(26个氨基酸残基)的78个碱基对;(2)编码α-亚基(209个氨基酸残基)的627个碱基对;(3)编码间隔肽(54个氨基酸残基)的162个碱基对;(4)编码β亚基(557个氨基酸残基)的1671个碱基对。此外,我们还发现起始密码子(ATG)前有个核糖体结合位点和启动子序列以及在终止密码子(TAA)之后有个转录终止信号。与最近发表的青霉素G酰化酶基因的DNA序列比较,同源性达99.7%。     

额外的错配碱基提高T4 DNA连接酶等位特异性连接

连接是一种主要的DNA处理过程。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4 DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本文评估了在T4 DNA连接酶介导的连接反应中,引入额外的错配碱基对所产生的影响。设计了超过150组DNA/DNA或DNA/RNA带有的额外错配碱基对的组合。结果发现,引入额外的错配碱基对后,T4 DNA 连接酶在DNA/DNA连接中特异性可提高60倍以上,而在DNA/RNA连接中特异性只能提高2倍。在等位特异性连接中,有的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。     

额外的错配碱基提高T4 DNA连接酶等位特异性连接（英文）

连接是一种主要的DNA处理过程。由于较低的商业成本以及核酸底物识别的灵活性,T4DNA连接酶被广泛应用于生物分子工程,特别是特定核酸序列的等位特异性连接检测。本文评估了在T4 DNA连接酶介导的连接反应中,引入额外的错配碱基对所产生的影响。设计了超过150组DNA/DNA或DNA/RNA带有的额外错配碱基对的组合。结果发现,引入额外的错配碱基对后,T4 DNA连接酶在DNA/DNA连接中特异性可提高60倍以上,而在DNA/RNA连接中特异性只能提高2倍。在等位特异性连接中,有的错配碱基对可使T4 DNA连接酶的特异性提高600多倍。     

抗菌肽AD基因的合成

设计并合成了一种新型抗菌肽基因,合成的抗菌肽(cecropin)AD基因全长140个碱基对,克隆于pCR^TM2.1载体上,经DNA序列分析证实,合成的cecropin AD基因的碱基序列与设计序列完全一致.     

用低温熔化琼脂糖的叶绿体DNA的酶切图谱

DNA分子的限制性核酸内切酶谱为我们提供了与生化,遗传作用以及进化有关的物质基础。这也是核酸序列测定工作的起点。对于叶绿体DNA那样大小的各种DNA[110一180千碱基对(Kbp)],构建酶切图谱所采用的方法,通常包括从电泳凝胶中获得DNA片段以及其他过程。这里并不准备叙述那些化费时间而又常常没有效果的步骤。     

人工合成DNA创造“全新微生物”

<正>英国《自然》杂志1月7日公布的一项合成生物学研究显示,科学家首次将人工合成碱基对插入大肠杆菌的DNA中,且并未影响其生长和复制过程。这一成果向利用合成技术"订制"特定生物组织迈进一步。美国研究人员构建出一种自然界不存在的生物体,它稳定包含一种代号为"X-Y"的人工碱基对。在最新研究中,研究人员合成了一段包含天然碱基对和人工碱基对的DNA,将其插入大肠杆菌细胞中。研究的突破之一是发现了一种特殊的转运分子,这种由一种微藻生成的三磷酸转运蛋白,能够运输人造碱基对进入细胞。结果显示,DNA能以适当的速度和准确度进行复制,被改造的大肠杆菌细胞仍继续生长,人工碱基对也没有被去除。研究负责人、斯克里普     

部分柔性的核酸双螺旋构象的模型化研究

基于核酸结构单元的基本思想,在分析给出任意碱基对片段的自由度集合和两碱基对片段的简化自由度集合的基础上,建立了DNA/m5cDNA/RNA双螺旋结构的理论模型和两碱基对部分柔性的构象计算方法.利用本方法获得的标准B-DNA双螺旋构象参数与实验基本一致.根据DNA嵌插受体的统计性实验约束,优化产生了适用于阿霉素类抗癌药的三碱基对DNA片段的理论嵌插受体模型.     

杨尺蠖核型多角体病毒的DNA特性

本文报道了AciNPV-DNA的纯化及特性,证明纯化DNA具有典型紫外吸收光谱,在Sepharose 2B柱层析和超离心沉降分析中呈单一峰,Tm值为70.2℃,其(G+C)％=39.8％,增色效应为34％,限制性内切酶Pst Ⅰ,PvuⅡ,SaI Ⅰ,Eco R Ⅰ,BgI Ⅰ,XhoⅠ,Bgl Ⅱ酶切DNA,分别产生4,6,22,20,11,5,7个DNA片段,某些酶切电泳图谱中观察到亚分子片段,Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ双醇切DNA分子产生26个片段,Eco R Ⅰ酶切片段积加DNA分子量为56.55×10~6道尔顿,约85.70千碱基对,电镜观察DNA分子有线状和环状,环状分子长约27.38μ,分子量约为53.94×10~(?)道尔顿,以Eco R Ⅰ对1981～1985年林间连续复制回收的AciNPV的DNA同源性进行检测,结果无变化,AciNPV攻毒枣尺蠖幼虫所得枣尺蠖NPV,其DNA的Bgl Ⅱ图谱与AciNPV-DNA的Bgl Ⅰ酶谱有明显的差异。     

基因敲入技术的突破

Baylor医学院的KoenVenken博士创新了基因敲入技术，这一突破使生物学家向果蝇体内敲入大量的DNA成为可能。传统的方法只能在果蝇基因组中插入较小的DNA片段，Venken的方法可将20000到133000大小碱基对的DNA敲入果蝇基因组。传统上，生物学家利用果蝇基因组中的P元素能够整合外源性DNA片段的特性，将目标DNA片段插入P元素，再将含有外源性DNA的P元素复合体导入果蝇基因组。这一传统方法能整合的DNA片段长度有限。Venken在研究中需要敲入很长的DNA片段到果蝇体内。于是他将含有DNA片段的P元素转入到质粒里，质粒能够较P元素自身更稳定地携带大片断DNA。     

《自然》:专家首次为大肠杆菌植入人工碱基对

英国《自然》杂志近日公布的一项合成生物学研究显示,科学家首次将人工合成碱基对插入大肠杆菌的DNA(脱氧核糖核酸)中,且并未影响其生长和复制过程。这一成果向利用合成技术"订制"特定生物组织迈进一步。遗传物质DNA由两条很长的糖链结构形成骨架,通过碱基对的结合形成稳定的螺旋结构。自然界的生命多姿多彩,最基本的碱基对却只有两种:腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)和胞嘧啶-鸟嘌呤(C-G)。但美国研究人员构建出一种自然界不存在的生物体,它稳定包含一种代号为"X-Y"的     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

抗菌肽BuforinⅡ衍生物与大肠杆菌基因组DNA的作用机制

【目的】研究抗菌肽BuforinⅡ的衍生物BF2-A/B与大肠杆菌基因组DNA的作用机制。【方法】琼脂糖电泳检测肽对DNA的断裂作用,凝胶阻滞实验研究肽与DNA的结合作用,圆二色谱考察结合肽后DNA结构的变化,荧光光谱分析肽与溴化乙锭竞争性嵌入DNA以及磷酸根对肽与DNA相互作用的影响。【结果】BF2-A/B不断裂基因组DNA而是结合DNA,使DNA双螺旋结构变得松散,削弱碱基对间的堆积作用,并取代EB,使EB-DNA复合体系荧光减弱。而PO43-的加入减弱了肽对DNA-EB荧光的淬灭作用。【结论】衍生肽与DNA的结合方式是先靠静电引力吸附到DNA磷酸基团上,随即插入双螺旋沟槽,嵌入碱基对间。BF2-B有更多的正电荷,更强的插入沟槽和嵌入碱基对的能力,使得其结合DNA的能力比BF2-A强。     

超螺旋之异见

种种证据显示DNA中的两条链可能并不是像经典双螺旋模型指出的那样完全以右旋的方式互绕在一起,在天然DNA分子中实际上有很多左旋的成份。基于这种对DNA结构认识上的小小差异,作者试图对DNA拓扑学中遇到的一些现象提出一些不同于文献的看法——正超螺旋是左旋占优势的DNA;其互补双链并不是比正常情况的双链绕得更紧,而是相反;左旋DNA的双螺旋周期为12个碱基对;正超螺旋可能是耐高温菌保护DNA结构稳定性的主要因素。当然这些认识还必须经得起实验的检查和时间的考验。     

肠杆菌膜蛋白基因的研究——Ⅳ.大肠杆菌染色体DNA Hind Ⅲ酶解片段上

大肠杆菌野生株JE5506(1pp~ )和突变株JE5505(1pp~-)的染色体DNA的Hind Ⅲ酶解片段,与一带有大肠杆菌外膜脂蛋白信号肽基因的107bp探针,在20℃下进行DNA-DNA杂交,在25kb和3.4kb处各出现一杂交带。该两片段与载体质粒pBR322在体外进行DNA重组,分别得到pHWO14和pHWO15两个重组质粒。该两重组质粒的限制性内切酶酶切图谱,Southern印迹及与107bp探针杂交的实验结果,进一步证明了上述两个DNA片段上存在有与脂蛋白信号肽基因同源的序列。pHWO15质粒编码的蛋白质经鉴定证明是脂蛋白(见另文发表)。pHWO14质粒在微细胞内的表达产物虽不是脂蛋白,但DNA序列分析证明它与脂蛋白信号肽基因同源的序列是信号肽断裂位点周围高度保守的15个碱基对。     

基因功能的详细分析

在DNA中除包含形成蛋白质结构信息的结构基因外,还包含有控制什么时候及如何能精确读出结构基因的一种控制基因。控制基因的每个片段的功能,直到现在还没有能详细知悉(与结构基因对比来说)。分子生物学家Steren L.Mc Knight和Robert Knigsbury在西雅图的癌研究所里,研究获得很有意义的单个的碱基对,也即是很小的、还能够析定的基因单位。     

紫外线B区对小牛胸腺DNA损伤的拉曼光谱研究

用拉曼光谱检测了远紫外区UVB(280m～320nm)对小牛胸腺DNA的损伤,并对这个区段紫外线对DNA的不同照射时间时的损伤特征进行了比较分析。实验中所用的紫外线强度与太阳光强度相当。结果表明,辐照3h以内时,UVB对DNA的构型有较明显的损伤,这可能是受到嘧啶碱基损伤的影响。相对而言,UVB对脱氧核糖和碱基的损伤要严厉得多。就碱基对的受损伤程度来说,嘧啶碱受损最严重,部分证明了环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物的形成。经过3h UVB照射,AT碱基对和和胞嘧啶环的堆叠程度有所瓦解,一些碱基对受到修饰。而一些拉曼特征峰强度的反复波动,则说明了长时间的紫外照射可以导致部分DNA光复活的产生。进一步分析发现,UVB以一种较快的方式对DNA产生损伤。     

DNA甲基转移酶

DNA甲基化在基因调节和动物发育中起着重要作用。负责DNA甲基化作用的酶尔为DNA甲基转移酶（Dnmts）。到目前为止,在哺乳动物细胞中已经鉴定了三种DNA甲基转移酶基因家族,即Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3。鉴定和研究DNA甲基转移酶对阐明DNA甲基化机制起着关键的作用。     

分子进化与中立说(续)

(五)基因重复与中立说 生物进化过程中,从低级到高级,构成基因组的DNA量一般也随着增加。例如病毒基因组只有几千个碱基对,而哺乳动物有3×10~9个碱基对,大致上增加50万倍。哺乳动物跟大肠杆菌那样的细菌相比,DNA量大致上增加一千倍。这样大量的DNA大部分是由遗传物质的重复而来的。象根井(M.Nei)所指出的那样,如DNA全部重复增加,     

缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑中的应用

目前Ⅱ型CRISPR/Cas9工具被广泛应用于基因组编辑中,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌(Escherichia coli)基因组进行编辑,可应用于代谢工程及细菌耐药性等研究领域中。利用单缺口核酸酶Cas9 nickase (Cas9n)工具对宿主细胞基因进行修饰,可降低由于双链断裂对宿主带来的毒性。但目前利用CRISPR/Cas9n对大肠杆菌基因组编辑的研究较少,不利于缺口酶Cas9 D10A和Cas9 H840A在大肠杆菌基因组编辑的应用。本研究在前人报道的细菌双质粒Cas9基因编辑系统(pCas/pTarget)基础上,通过分子突变的方法构建缺口酶Cas9突变体质粒pCas-D10A和pCas-H840A,以及携带修复模板或无修复模板的靶向大肠杆菌sseA基因的质粒pTargetT-△sseA(993 bp)和pTargetT-△sseA,系统研究了两种缺口酶编辑大肠杆菌内源性基因sseA的有效性和效率。在稳定表达pCas质粒的MG1655菌株中转入携带修复模板的pTargetT-△sseA(993 bp)质粒,通过菌落PCR及DNA测序方法验证基因编辑的有...     

人干细胞因子cDNA的设计、合成与克隆

选择大肠杆菌的偏爱密码子,分成18个长约60个碱基且相互配对的寡核苷酸片段,合成了可溶形式的人干细胞因子（hSCF)的cDNA,合成片段经纯化、5′-端磷酸化后,通过PCR进行合成hSCF的cDNA一次性组装与扩增,得到了含有可溶形式的hSCF的全部编码区及EcoRⅠ、SalⅠ位点在内的全长共515个碱基对的DNA片段,回收该DNA片段,酶切消化,定向克隆进质粒pUC19。经酶切鉴定以及序列测定,得到了全序列正确的克隆株,为下一步的工作奠定了基础。