细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

乙型肝炎病毒adr和adw亚型表面抗原在非洲绿猴肾细胞中的表达

用pSV2-gPt作载体,将乙型肝炎病毒adr亚型的全序列基因和adw亚型的Bgl Ⅱ大片段DNA分别插入PSV 2-gpt BamHI及Bgl Ⅱ切口,获得4种重组质粒。它们都含有SV40DNA复制起始点、早期启动子、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)和氨苄青霉素抗性基因(Apr)。经酶切鉴定,选出正向重组质粒PSV 2-gbr1和pSV 2-gbw1,并分别转化Vero细胞,在选择培养基的压力下,两个质粒所含乙型肝炎表面抗原DNA均得到表达。     

改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体

为了构建改良型痘苗病毒安卡拉株表达系统可删除筛选标记的双表达穿梭载体,利用Cre/LoxP DNA重组系统以及本实验室表达Cre酶的BHK-21细胞系 (BHK-Cre),以大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Eco gpt) 为筛选标记构建可删除筛选标记的双表达穿梭载体pLR-gpt。将Eco gpt 基因以及调控其表达的启动子基因置于2个同向的LoxP位点之间,2个独立的多克隆位点位于2个LoxP位点之外,最终获得的重组病毒可以在BHK-Cre细胞系上删除筛选标记Eco gpt。为了验证系统的有效     

大肠杆菌O54 O-抗原基因簇的破译及进化分析

破译了大肠杆菌O5 4O 抗原基因簇的序列 ,序列全长 1 4 0 6 2bp。用生物信息学方法分析序列并鉴定基因 ,共确定 1 0个基因 ,包括鼠李糖合成酶基因BDA和C(rmlBDA和rmlC) ,糖基转移酶基因 ,O 抗原转运酶基因 ,O 抗原聚合酶基因和合成磷酸丝氨酸侧链的基因及 1个不能确定功能的开放阅读框。对rmlC的 (G C) %含量 ,稀有密码子含量及进化分析都表明大肠杆菌O5 4O 抗原基因簇是在近期通过rmlC介导的重组形成 ,而且大肠杆菌O5 4和鲍氏志贺氏菌 9型的亲缘关系很近。对UTP 葡萄糖 1 磷酸 尿苷转移酶基因 (galF)和 6 磷酸葡萄糖脱氢酶基因(gnd)的进化分析揭示志贺氏菌属与大肠杆菌属在进化上属于同一个属。用PCR方法筛选出了针对大肠杆菌O5 4的特异基因 ,用于基因芯片或PCR方法对大肠杆菌O5 4的快速检测。     

用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

人β干挠素基因在SV40晚期启动子控制下在小鼠骨髓瘤细胞中表达

人成纤维细胞干挠素(Hu-IFN-β)基因的HindⅡ片段,插入载体pSV2-dhfr质粒中SV40晚期启动子(Lp)下游PvuⅡ位点处。用此重组质粒与带有黄嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因的质粒pSV2-gpt共转染次黄嘌吟核糖转移酶(HGPRT)基因缺陷的小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞。在含有霉酚酸和氨基喋呤的选择培基中,筛选出有效地组成性表达的细胞株。在未加氨甲喋呤压力倍增的条件下,Hu-IFN-β抗病毒活性为1275U/10~5细胞,1ml,48小时。     

大肠杆菌PTS系统改造及重组菌生长性能测定

利用Red重组系统对野生大肠杆菌Escherichia coli磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system,PTS)进行修饰改造,敲除PTS系统中关键组分EⅡCBGlc的编码基因(ptsG),磷酸组氨酸搬运蛋白HPr的编码基因(ptsI),同时敲入来源于运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis的葡萄糖易化体(Glucose facilitator)编码基因(glf),构建重组大肠杆菌,比较测定并系统评价了基因敲除和敲入对细胞的生长、葡萄糖代谢和乙酸积累的影响。敲除基因ptsG和ptsI造成大肠杆菌PTS系统部分功能缺失,细胞生长受到一定限制,敲入glf基因后,重组大肠杆菌能够利用Glf-Glk(葡萄糖易化体-葡萄糖激酶)途径,消耗ATP将葡萄糖进行磷酸化并转运进入细胞。通过该途径转运葡萄糖能够提高葡萄糖利用效率,降低副产物乙酸生成,同时能够使更多的碳代谢流进入后续相关合成途径,预期能够提高相关产物产量。     

细胞和组织中的O~6-甲基脱氧鸟嘌呤核苷的脱甲基作用

为了探讨细胞和组织中的O~6-甲基脱氧鸟嘌呤核苷的脱甲基作用,我们合成了[~3H]O~6-mGua DNA、O~6-mdGuo、O~6-mdGMP、O~6-mdGTP等底物,在体外利用高压液相色谱分析细胞和组织提取物去除鸟嘌呤基团第六位氧原子上甲基的能力。结果表明,在细胞和组织提取物中存在一种去甲基酶,它能去除O~6-甲基脱氧鸟嘌呤核苷、O~6-甲基脱氧鸟嘌呤核苷-磷酸上的甲基,生成脱氧鸟嘌呤核苷或脱氧鸟嘌呤核苷-磷酸,并伴随着甲醇的释放。它不同于DNA甲基转移酶。没有观察到它对O~6-甲基鸟嘌呤DNA、O~6-甲基脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸、O~4-甲基胸腺嘧啶核苷以及O~6-甲基鸟嘌呤的去甲基作用。     

α1,2-岩藻糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法从幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)基因组DNA中获得α1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fuco-syltransferase,α1,2-fuct)基因,得到大小为906 bp的目的基因,将其定向插入到原核表达载体pET-22b(+)中,得到重组表达载体pET-fuct。将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,25℃,0.1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h,并用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,可表达出相对分子质量为33 kD的蛋白,与预期分子量一致,说明α1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌BL21中实现表达,应用HPLC法进行酶活检验,酶活达到了13.21 pmol/(mgPr.h)。     

理性设计和构建过量合成莽草酸的大肠杆菌代谢工程菌

利用代谢工程手段理性改造野生大肠杆菌的莽草酸(Shikimic acid,SA)合成途径及相关代谢节点,以构建高产莽草酸的工程菌株.根据细胞代谢网络分析,利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶基因(aroL、aroK),葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键组分EIICBglc的编码基因(ptsG)以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响.aroL、aroK的删除阻断了莽草酸进一步转化成为莽草酸-3-磷酸,初步提高莽草酸的累积.删除ptsG基因使大肠杆菌PTS系统部分缺失,细胞通过GalP-glk(半乳糖透性酶-葡萄糖激酶)途径,利用ATP将葡萄糖磷酸化后进入细胞.利用该途径运输葡萄糖能够减少PEP的消耗,使得更多的碳代谢流进入莽草酸合成途径,从而显著提高了莽草酸的产量.在此基础上删除ydiB基因,阻止了莽草酸合成的前体物质3-脱氢奎宁酸转化为副产物奎宁酸(Quinic acid,QA),进一步提高了莽草酸的累积.初步发酵显示4个基因缺失的大肠杆菌代谢工程菌生产莽草酸的能力比原始菌提高了90多倍.     

甾醇C-24甲基转移酶基因在酿酒酵母中的内源表达及工程菌麦角甾醇的合成

通过高保真PCR克隆到含酿酒酵母甾醇C-24甲基转移酶基因编码序列及终止子序列的DNA片段ERG6, 以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体, 磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pPERG6。通过同源重组, 以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换染色体上ERG6基因内部序列获得ERG6破坏菌株YS58-erg6, 其中麦角甾醇的合成被阻断, 同时细胞的生长也受到明显抑制。表达质粒pPERG6转化破坏菌株YS58-erg6后, 不但使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力, 细胞生物量也得到明显提高, 这说明表达质粒上的ERG6基因得到了功能性的表达。分别用载体质粒YEp352和表达质粒pPERG6转化酿酒酵母单倍体菌株YS58, 获得对照菌株YS58(YEp352)和重组菌株YS58(pPERG6)。重组菌株YS58(pPERG6) 生物量和麦角甾醇含量分别是对照菌YS58(YEp352)的1.23和1.32倍。可见甾醇C-24甲基转移酶基因的高表达可以增强酵母细胞麦角甾醇的合成能力。     

利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为GGTA1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪GGTA1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了GGTA1单等位基因敲除的胎儿,为培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。     

火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建

火鸡疱疹病毒(HVT)为一种-疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗.[目的]本研究的目的是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC).[方法]利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和BAC载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体Pgab-gpt-BAC11.通过将Pgab-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断核酸代谢途径,经过筛选获得纯化的重组病毒purified-Rhvt.提取purified-Rhvt感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,并用酶切和PCR方法对其进行鉴定.随机选取BAC克隆提取BAC DNA转染次代CEF,完成HVT重组病毒的拯救.[结果]经过6轮筛选后获得纯化的重组病毒,并筛选到25个BAC分子克隆化病毒.其中BAC6、BAC8和BAC10再次启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒.[结论]本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台.     

大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L-phe生产的影响

L-phe是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影响,在大肠杆菌PTS系统中,葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得。利用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除,得到PTS缺陷菌株MD-ptsG-。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe产量提高12%。     

抗8氮鸟嘌呤的F9胚胎癌细胞突变株的建株

近年来,小鼠胚胎癌细胞(EC 细胞)已成为研究胚胎分化、肿瘤发生的一个很好的实验模型。利用体外培养的 EC 细胞,通过诱变剂处理和筛选,可以获得具有特定基因突变标记的 EC 细胞株。例如利用碱基类似物8氮鸟嘌呤(8AG)或5-溴脱氧尿嘧啶核苷可以分别筛选到次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷或胸腺嘧啶核苷激酶(TK)缺陷的突变株。前者同时又是人类列许尼汉(Lesch-nyhan)综合症的病因。因此建立这种类型的突变株,不仪可以利用酶的缺陷突变作为细胞融合的选择     

Knockout of ptsG Gene in Escherichia coli and Its Influence on Production of L-phenylalanine

L-phe 是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成 phe 时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对 phe 产量合成有很大影响,在大肠杆菌 PTS 系统中,葡糖糖主要由 ptsG 基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得.利用 Red 同源重组技术将大肠杆菌染色体上的 ptsG 基因进行敲除,得到 PTS 缺陷菌株 MD-ptsG-.该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe 产量提高12％.     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5a、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株：DH5αP,JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α,JM109的3．47倍和4．25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子(TNF)在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24．3％、20．8％,A600分别为8．28、7．62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

人MGMT基因Cdna的克隆表达及表达蛋白修复功能的鉴定

克隆了Hela细胞O6 甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (MGMT)基因的cDNA序列 ,该序列与国外发表的cDNA完全一致。将此cDNA插入原核表达载体pET 2 1a后转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达的重组菌株pET 2 1a MGMT E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后产生分子量为 2 4kD的蛋白质。烷化类诱变剂致死突变实验表明 ,MGMT蛋白的表达能修复受体菌DNA分子因烷化类诱变剂导致的突变。     

火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶基因克隆、表达纯化和酶学性质研究

【目的】在大肠杆菌中表达火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,纯化得到重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,在此基础上系统研究火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学特征。【方法】构建8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶重组表达质粒,将重组质粒转化Escherichia coli Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达重组蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白;最后利用含8-氧鸟嘌呤损伤的寡核苷酸作为底物,测定8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质。【结果】在大肠杆菌中成功诱导表达了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,经Ni2+亲和纯化后蛋白纯度大于95%。在体外鉴定了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质。结果表明重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶可以切除DNA中的8-氧鸟嘌呤(8-Oxo-G,GO)损伤碱基,并且具有AP裂解酶活性。重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶催化反应的最适pH值和温度分别是pH 8.5和55°C。除Zn2+对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶促反应有明显的抑制作用外,实验中测定的其它二价离子(Mn2+,Mg2+,Ca2+,Ni2+,Co2+,Cu2+)对其没有明显的影响。离子强度在50-100 mmol/L范围内对其酶促反应影响不大,超过100 mmol/L时有明显的抑制作用。与8-氧鸟嘌呤互补的碱基差异对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶切除8-氧鸟嘌呤损伤的效率影响不大;但与单链DNA相比,双链DNA是优选底物,切割效率如下:GO/C≈GO/G≈GO/T≈GO/AGO/-。【结论】在大肠杆菌中成功表达,并Ni2+亲和纯化了火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,生化研究表明制备的重组蛋白具有8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶活性,可能负责切除火球菌基因组DNA中的8-氧鸟嘌呤损伤。     

棉铃虫核多角体病毒进化保守性基因iap2基因表达载体的构建及表达

分析棉铃虫核多角体病毒基因组 ,结合GenBank中已知的序列 ,发现iap2基因位于其基因组的BamHⅠ F片段上 ,回收此片段作为模板 ,设计引物 ,通过PCR扩增得到了抗细胞凋亡基因iap2的DNA片段。将扩增产物克隆到pGEM T载体上 ,再进一步将插入片段酶切并连接到表达载体pET 2 8a上 ,构建了重组质粒pET iap2。DNA序列分析结果表明 ,克隆得到的DNA序列与所发表序列完全相同。含重组质粒pET iap2的大肠杆菌BL2 1 (DE3)表达了抗细胞凋亡蛋白IAP2。