制服口蹄疫FMDV基因工程疫苗获得成功

口蹄疫是家畜最有破坏力的疾病,它是由口蹄疫病毒所引起的。1967——1968年期间由于这种病疫的流行造成重大损失,将近50万头家畜受毁。 抗口蹄疫病毒疫苗是制服这种病害的有力工具,通常获得这种疫苗是靠组织培养制取,用乙酰乙烯脒(acetylethylenimine)较易纯化,获得免疫力较强,并持续3——6个月(Marwick C.)。但这种制法常受到很大限制,也不便宜,为此,美国近几年来便用基因工程方法制取疫苗取得进展,他们将口蹄疫病毒VP3外壳蛋白(注:FMDV粒子含有四种衣壳蛋白即VP1、VP2、VP3、VP4,是在感染细胞中合成)基因插入到pBR     

以猪IgG重链恒定区为抗原载体的抗口蹄疫病毒DNA疫苗的研制

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病之一,主要危害猪、牛、羊等偶蹄动物.FMD的致病原为FMD病毒(FMDV),属小RNA病毒科口蹄疫病毒属,有A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ及AsiaⅠ共7个血清型.FMDV结构较简单,完整的病毒颗粒由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3及VP4各60个拷贝构成的衣壳包裹一条单股正链RNA组成,其中VP1是主要的抗原蛋白[1].     

猪O型口蹄疫病毒细菌样颗粒疫苗的制备与免疫原性鉴定

验证基于革兰氏阳性增强基质(Gram-positive enhancer matrix,GEM)展示口蹄疫病毒细菌样颗粒(Bacteria-like particles,BLP)疫苗的可行性。按照大肠杆菌偏好性密码子优化合成基于猪口蹄疫病毒Mya98株序列的3种抗原基因设计,并将其插入到含有锚钩蛋白基因的原核表达载体p QZ-PA,鉴定阳性后转入Escherichia coli BL21,进行诱导表达。利用SDS-PAGE与Western blotting对目的基因表达及产物的可溶性进行分析。利用GEM颗粒纯化目的蛋白,制备细菌样颗粒疫苗抗原;利用BCA试剂盒测定重组蛋白的浓度,将重组蛋白与白油佐剂乳化,制备疫苗,免疫5周龄小鼠,同时设商品化多肽苗对照与空白对照,免疫后不同时间采集试验小鼠血清,利用口蹄疫病毒多肽ELISA抗体检测试剂盒和O型口蹄疫抗体液相阻断酶联免疫(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒检测免疫小鼠血清的抗体水平;利用噻唑蓝比色法(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)测定淋巴细胞增殖情况;利用荧光定量PCR方法检测相关细胞因子表达,评价细胞免疫水平。SDS-PAGE结果表明,设计在大肠杆菌中的3种口蹄疫病毒抗原基因均以可溶形式获得高效表达;Western blotting结果显示,表达的重组蛋白能够与口蹄疫病毒阳性血清发生反应,利用GEM颗粒能够实现重组蛋白的一步离心纯化,制备BLP疫苗抗原;免疫试验结果表明,设计的重组抗原B(T1BT2)4B不但能够刺激免疫小鼠产生更高水平的多肽特异性ELISA抗体与口蹄疫特异性液相阻断抗体,而且产生了更高水平的脾淋巴细胞增殖及Th1型的细胞因子分泌。初步实验结果表明,本研究制备的BLP疫苗GEM-B(T1BT2)4B具有良好的免疫原性,为研究口蹄疫病毒基因工程亚单位疫苗开辟了一条新的思路。     

口蹄疫病毒三价复合多表位佐剂DNA疫苗构建及其免疫原性

以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,在此基础上,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)为基因佐剂,通过分子设计构建了SEA与OAAT融合表达基因。将构建好的表达盒OAAT与SEA融合表达基因克隆至真核表达载体PVAX1PCMV启动子下游,构建了口蹄疫三价基因佐剂DNA疫苗pEA。经Western blotting和IFA检测,目的蛋白在Hela细胞中获得正确表达。小鼠免疫实验表明,pA和pEA免疫组的血清抗体均能分别与O型、A型和AsiaI抗原反应,与对照组相比差异较显著,且pEA免疫组和灭活疫苗免疫组抗体水平均显著高于pA免疫组;同时pA和pEA免疫小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10较对照组显著提高,且pEA免疫组的IL-2、IFN-γ和IL-4水平明显高于pA免疫组。用O/NY00和Asia1/YNBS/58株FMDV进行...     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上。本研究首次成功测定了 Asia1 型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因( p1 区)的核苷酸序列,全长 2199 个碱基,编码 733 个氨基酸,该基因与 Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2 毒株的 p1 基因核苷酸序列同源性分别为 88. 4%、86. 0%、89. 3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为 94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与 Ind63/72、Pka3/54、Israel株的 vp1、vp2、vp3、vp4 基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在 42-50 位和 137-156 位。实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达 90%以上,本实验为进一步研究 A sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础。     

表达O型口蹄疫病毒VPl基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

[目的]为了构建表达口蹄疫病毒(O/china/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体.[方法]利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒.通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/gE-/VP1.[结果]PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Westem blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达.[结论]本研究成功地构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础.     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

编码山羊补体C3d与口蹄疫病毒VP1融合蛋白重组质粒的构建及表达

旨在构建含分子佐剂山羊补体C3d基因的O型口蹄疫病毒VP1基因真核表达质粒。克隆山羊C3d基因, 通过linker(G4S)2将3拷贝C3d基因串联; 克隆羊源O型口蹄疫病毒VP1基因, 通过linker(G4S)2与3拷贝C3d基因相连, 构建重组质粒pUC19-VP1-C3d3。将VP1-C3d3融合基因亚克隆入含有分泌表达信号肽tPA序列的pcDNA3.1(+)CMV启动子下游, 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3。在脂质体介导下, 将pcDNA3.1-tPA -VP1-C3d3转染HeLa细胞。间接免疫荧光分析表明, VP1- C3d3在HeLa细胞中获得了瞬时表达, Western blot分析证实转染的阳性细胞能分泌预期大小(133 kD)的融合蛋白。重组质粒pcDNA3.1-tPA-VP1-C3d3为研制以羊补体C3d为分子佐剂的口蹄疫新型疫苗奠定了基础。     

一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒 VP1 蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗 (P＜0.01) 和OA-VP1免疫组(P＜0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+ T细胞数量显著增多,IFN-γ产生水平显著升高 (P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。     

Asia1型口蹄疫病毒分离株结构蛋白基因的克隆与表达

口蹄疫病毒结构蛋白氨基酸的变化是病毒抗原性变异的分子基础,大部分抗原表位位于主要的免疫原蛋白VP1上,部分非线性抗原表位位于VP2和VP3上.本研究首次成功测定了Asia1型口蹄疫病毒(YNBS/58)四种结构蛋白基因(p1区)的核苷酸序列,全长2199个碱基,编码733个氨基酸,该基因与Ind63/72、Pka3/54、Israel、China/99、C1/Germany、A22、ZIM7/83/2毒株的p1基因核苷酸序列同源性分别为88.4%、86.0%、89.3%、68.6%、67.6%、66.8%、50.3%,推导的氨基酸序列同源性分别为94.1%、93.2%、95.1%、79.9%、77.0%、76.5%、58.1%;将YNBS/58株与Ind63/72、Pka3/54、Israel株的vp1、vp2、vp3、vp4基因和编码蛋白分别进行同源性比较,发现VP1的序列变异最大,VP2、VP3、VP4次之,且VP1的氨基酸变异主要集中在42-50位和137-156位.实现了YNBS/58株结构蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达,其表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量约为88kDa,占菌体总蛋白的16%左右,并利用镍柱对目的蛋白进行了纯化,纯度达90%以上,本实验为进一步研究A-sia1型口蹄疫病毒的分子流行病学、p1基因及其编码蛋白的生物学功能奠定了基础.     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

共表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性

[目的]筛选稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)株.[方法]采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法从重组质粒pMD-P1-2A和pMD-3C中分别扩增口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因,将两基因依次插入逆转录病毒载体pBABE-puro.重组逆转录病毒载体pBABE-puro/P1-2A-3C和pVSV-G质粒载体用脂质体介导共转染GP2-293包装细胞.产生的重组逆转录病毒感染MDBK细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性细胞.利用克隆环套取法得到单克隆细胞.经间接免疫荧光和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法检测MDBK细胞中衣壳蛋白的表达,并在电镜下观察口蹄疫病毒空衣壳.[结果]成功筛选到稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的MDBK细胞株,衣壳前体蛋白P1-2A在蛋白酶3C裂解作用下正确组装成空衣壳.[结论]该研究为口蹄疫亚单位疫苗的研制提供了实验材料.     

鸡白细胞介素2增强传染性法氏囊病病毒多聚蛋白DNA疫苗免疫原性的研究

鸡白细胞介素 2(IL-2)基因是新近被确定的非哺乳类IL-2基因。将鸡白细胞介素2(IL-2)基因和传染性法氏囊病病毒 (IBDV)多聚蛋白基因 (VP2/VP4/VP3)分别插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游 ,制备DNA疫苗 ,免疫 14日龄SPF鸡 ,14d后二免 ,二免后 3d攻击标准强毒株。结果表明共注射鸡IL 2质粒能明显增强DNA疫苗对强毒攻击 ,保护率达 80 % ;能增强DNA疫苗诱导的中和抗体效价 (P<0.05 ) ;能显著促进鸡胸腺、脾脏和外周血液T淋巴细胞及法氏囊B淋巴细胞增殖反应(P<0.05)。这些结果提示鸡IL 2能明显增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫原性 ,是一种优良的禽类DNA疫苗佐剂。     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257–264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大。     

转基因植物作为生物反应器生产口蹄疫疫苗的研究进展

利用转基因植物作为生物反应器表达重组蛋白,生产外源蛋白质作为动物疫苗是一个很有吸引力的廉价生产系统,它有可能代替生产成本较高的传统疫苗的发酵生产系统。通过口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因在转基因植物中的表达,口蹄疫疫苗已在植物中产生。在植物中生产的抗原能够保持其自身的免疫原性。本文简要综述了近十年来用转基因植物作为生物反应器生产口蹄疫疫苗的研究进展、特点及其应用前景 。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力

【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体。首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培 养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV- VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX △E3VP2。用Sal I Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2 全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2。Cla I Asc I酶切pCAV-2-FPV- VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2。该重组病毒能使MDCK细胞产生 腺病毒样细胞病变。Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白。该重组病毒可以有 效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体。本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株。     

克隆的口蹄疫病毒蛋白疫苗——在牛和猪体内的反应

从口蹄疫病毒A_(12)的病毒粒子RNA中制取得到编码其致免疫的衣壳蛋白VP_3的DNA序列,并把它接到质粒上,通过大肠杆菌色氨酸起动—操纵系统表达出一个嵌合蛋白。当被这个质粒转化的大肠杆菌在无色氨酸培养基上生长时,全部细胞蛋白中有大约17％是不溶性的,稳定嵌合蛋白。纯化的嵌合蛋白与口蹄疫病毒的VP_3蛋白等克分子地竞争抗口蹄病毒的特异性抗体。给六头牛、二头猪接种这种蛋白能诱发出高水平的中和抗体和抗口蹄疫病毒侵袭的保护反应。