根瘤菌共生固氮的遗传学研究(二)

2.在根瘤菌研究中成功地运用了转座子诱变技术。转座子(Transposon)是一种特殊的DNA短片段,它带有抗药性基因,并具有在DNA复制子之间转座插入的能力,转座的发生并不需要recA基因产物,一些转座子象Tn 5的转座插入位点的分布是相当随机的,但另一些象Tn 10,它的转座插入似乎具有“热点”(Hot spot),转座子插入到一个新位点时,被插入位点原基因的连续性受到阻断,因而该基因的功     

IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的结构基因组学分析

【背景】IncFII-FIA-FIB型质粒广泛存在于肠杆菌科细菌中,介导了许多耐药基因的水平转移,并导致细菌多重耐药问题日益严重。【目的】分析IncFII-FIA-FIB型多重耐药质粒pBTR-CTXM的基因组结构,并研究其介导大肠杆菌BTR株的耐药基因水平转移机制。【方法】利用PCR进行耐药基因筛查;接合转移和电转化实验验证质粒pBTR-CTXM是否具备自主接合转移的特性;VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪测定相关菌株对抗生素的药物敏感性;构建MatePair文库并进行细菌全基因组高通量测序和质粒结构基因组学分析。【结果】菌株BTR是携带blaNDM-1、blaCTX-M-15、blaTEM、qnrD、qnrS1、mph(A)、erm(B)和tetA(B)等耐药基因的多重耐药大肠杆菌,其中blaCTX-M-15、mph(A)、erm(B)和tet A(B)等耐药基因均位于大小为144 939 bp的质粒p BTR-CTXM (GenBank登录号MF156697)上,该质粒可与菌株BTR内质粒pNDM-BTR接合共转移到受体菌大肠杆菌EC600中。pBTR-CTXM具备IncFII-FIA-FIB型质粒典型的骨架区结构,其多重耐药(Multidrug-resistant,MDR)区由新的复合型转座子Tn6492、Tn2残余、Tn10残余、ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元和一些插入序列组成。【结论】pBTR-CTXM中新复合型转座子Tn6492与Tn10残余和ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477转座单元共同介导大肠杆菌BTR株的多重耐药与耐药基因的水平传播。     

转座子Tn233(CH)中转座基因的鉴定和定位

Tn233(CH)是从国内临床分离的耐药痢疾杆菌中找到的一个转座子,已经绘制了它的物理图,它与转座子Tn21基本相同。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ对带有转座子Tn233(CH)的质粒pBR322::Tn233(CH)进行不完全消化,如此产生的DNA片段经T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli C600细胞中,获得了一些保留有转座功能或失去了转座功能的转座子缺失变种。互补试验的结果表明,保留有转座功能的Tn233(CH)缺失变种在反式位置上对失去了转座功能的Tn233(CH)缺失变种有互补作用。对这些缺失变种在DNA上缺失的区域进行限制图分析,确定了转座子Tn233(CH)中转座基因的位置。     

α-氨基苄青霉素抗性转座子Tn2在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入区域特异性

转座子Tn2是大肠杆菌质粒RSF 1030上一段带有α-氨基苄青霉素抗性基因的DNA序列。这段序列具有转座能力,它能通过不同于一般的DNA重组机理从一个复制子转座到另一个复制子。已知,噬菌体Mu,插入序列IS1、IS2、IS3和抗药性转座子TnA、Tn5、Tn9、Tn10等均能使被插入的基因发生突变。已有报道,不同的转座子在E.coli K12乳糖操纵子Z基因中的插入模式不同。Mu噬菌体在Z基因     

嗜水气单胞菌若干毒力因子同时缺失的突变株的构建及特性分析

以携带质粒pAM12 0 (Tcr Tn916 )的大肠杆菌CG12 0株为供体菌 ,采用滤膜接合法与受体菌嗜水气单胞菌J_1株 (cfzr)进行接合转移 ,在含Tc和cfz选择平板上进行筛选。共获接合转移菌落 380 0个 ,其接合频率为 3× 10 - 5(按供体细胞计算 )。任取 38个接合子 ,提取基因组DNA ,以嗜水气单胞菌特异性 16SrDNA引物进行PCR扩增 ,所有接合子均阳性。为证明Tn916确实插入基因组 ,以四环素基因 (tet)引物进行PCR扩增 ,结果所有抗性接合子均扩增出一条特异条带。与亲本J_1株相比 ,所有接合子的主要毒力因子如蛋白酶、溶血素、DNA酶和淀粉酶等均不表达 ,对小鼠失去致病力 ,其LD50 大于 10 9CFU。接合子连传 10次后 ,四环素抗性消失 ,但毒力未恢复 ,说明通过转座子Tn916的插入可获得稳定的无毒嗜水气单胞菌突变株。Tn916引起嗜水气单胞菌毒力性状改变的机制有待研究 ,推测可能与该菌染色体上存在Tn916的热点或毒力岛有关。     

利用转座子Tn917构建单核细胞增生李斯特菌菌膜形成突变株

单核细胞增生李斯特菌菌膜形成相关基因和调控因子的分离和鉴定是阐明其菌膜形成分子机理的基础。利用原生质体转化这一方式,将带有转座子Tn917的质粒pTV1OK成功地转进了单核细胞增生李斯特菌。通过诱导Tn917转座,得到单核细胞增生李斯特菌Tn917插入突变库,转座率为10-7。经96孔细胞培养板筛选发现,菌株LM49形成菌膜能力明显大于野生型。该菌株在细胞培养板中培养４d后形成的紫色圆环的颜色明显深于野生型。用Tn917特异引物进行PCR扩增,结果显示只有以该突变株的DNA为模板才能得到相应大小的扩增产物,证实该菌株基因组中有Tn917插入。Tn917的插入使菌株LM49的菌膜形成能力增强。     

1株多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记研究

目的 了解多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因存在状况和遗传学背景。方法 聚合酶链反应(RCR)法对多重耐药的肺炎克雷伯菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、质粒AmpC酶基因、qacEΔ1-sull耐消毒剂和磺胺基因、整合子遗传标记(整合酶基因)、Tn21/Tn501转座子遗传标记(汞离子还原酶基因)检测。结果 TEM、SHV型β-内酰胺酶基因, DHA型质粒AmpC酶基因,aac(6′)-1型氮基糖苷类修饰酶基因,qacEΔ1-sul1耐消毒剂和磺胺基因,整合子遗传标记(intI1整合酶基因),Tn21/Tn501转座子遗传标记(merA汞离子还原酶基因)检测阳性。结论 多重耐药肺炎克雷伯菌存在多种耐药基因和Ⅰ类整合子、Tn21/Tn501转座子。     

新型二合一PiggyBac转座系统的构建及功能验证*

目的:PiggyBac(PB)转座子是一种可移动的遗传元件,采用“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行转座;通过将转座子元件和转座酶表达框整合到一个表达载体中,构建简便易用的二合一PB转座系统。方法:通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)获取PiggyBac转座系统所需转座子元件和转座酶表达框,利用T4 DNA连接酶将转座酶表达框插入到pUC18载体上,再利用Gibson同源重组技术将转座子元件与重组载体结合构建二合一PB转座系统;使用该系统携带的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以及功能性损伤抑制蛋白(damage-suppressing protein,DSUP)检测其有效性及可靠性。结果:在所有筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,EGFP都是明亮可见;利用此二合一PB转座系统成功获得了可高效表达功能性损伤抑制蛋白的稳定细胞系,证明外源基因可被有效整合到基因组DNA中并表达。结论:成功构建了新型二合一PB转座系统,使稳定表达细胞系的建立更加经济简便。     

携带armA基因的铜绿假单胞菌耐药性及基因周边环境

目的了解多重耐药(MDR)铜绿假单胞菌armA基因与可移动遗传元件的携带情况及其相关性;分析armA基因的周边环境,探讨armA基因转移的可能机制。方法收集MDR铜绿假单胞菌98株,琼脂稀释法测定MIC,PCR方法检测16S rRNA甲基化酶基因armA、I型整合子、可移动元件IS26及重要耐药基因侧翼基因环境,测序并拼接PCR产物明确耐药基因座位排列,并对armA基因进行周边序列分析。结果 98株MDR铜绿假单胞菌检出5株armA基因PCR扩增阳性,携带armA基因的菌株对庆大霉素和阿米卡星全耐药;检出20株携带I型整合子,17株携带可移动元件IS26;armA基因扩增阳性的菌株均携带I型整合子和IS26;序列测序显示armA定位于Tn1548相关区域,位于插入序列ISCR1的下游,该序列含多种移动元件。结论大连市氨基糖苷类高水平耐药基因armA广泛分布在MDR铜绿假单胞菌中,均对庆大霉素和阿米卡星高度耐药;该基因定位在转座子Tn1548的质粒上,提示16S rRNA甲基化酶基因armA的广泛播散可能是可移动元件ISCR1-armA-IS26结构参与其中。     

细菌中介导多重耐药的Tn7转座子研究进展

转座子是介导细菌耐药性传播的重要可移动遗传元件。Tn7转座子与细菌耐药密切相关,其携带转座模块和Ⅱ类整合子系统。Tn7编码转座相关蛋白TnsABCDE进行“剪切-粘贴”机制转座,转座核心TnsABC也可与三链DNA或Cas-RNA复合物结合实现转座。近年来新发现了多种介导多重耐药的Tn7转座子,其在介导细菌抗生素、消毒剂和重金属抗性基因的获得、传播扩散等方面发挥了重要作用。本文综述了细菌中Tn7转座子的遗传结构、转座机制、流行以及新发现的介导多重耐药的Tn7转座子,以期为细菌中Tn7转座子的深入研究提供参考。     

转座子Sleeping Beauty和PiggyBac

近10年来,得益于转座子Sleeping Beauty(SB)和PiggyBac(PB)的发现和完善,转座子作为一种遗传工程工具在脊椎动物的基因遗传研究中得到广泛应用.SB和PB宿主范围极其广泛,从单细胞生物到哺乳动物都能够发挥作用.转座过程需要转座序列和转座酶的存在,类似于"剪切"、"粘贴"的方式.转座子载体系统转座时可携带一段外源DNA序列,利用这一特性可以用于实现目的基因的转移,现已广泛用于转基因动物、基因功能研究、基因治疗等领域.当转座系统与基因捕获技术相结合,不仅可研究插入突变基因的功能,还能通过所携带的报告基因获得捕获基因的表达图谱.作为非病毒载体的SB和PB转座系统,由于具有高容量、高效率和高安全性等优势,并且PB在转座后不留任何足迹,不会造成遗传物质的不可预测改变,在动物基因工程以及基因治疗方面具有诱人的前景.     

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定水稻黄单胞菌 TAIL-PCR hrp基因簇 hpaB基因

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害.通过筛选18000个Xoo Tn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11.TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中.对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB.Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移.将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失.证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用.     

假单胞杆菌BS1转座突变及高产生物表面活性剂突变株初步筛选

利用含转座子Tn917的温敏性质粒pTV1-OK转化假单胞杆菌BS1原生质体,成功获得3个稳定的转化子;通过Tn917诱导转座突变,产生大量突变体,构建了转座突变体库,采用特异引物对随机挑取的5株突变体进行PCR扩增,获得与预期大小一致片段,表明突变体基因组中有Tn917插入;通过对随机挑取24株突变体乳化(E24)性能测定,发现有一株突变体E24值达到67%,明显高于野生菌株。结果表明转座突变是假单胞杆菌BS1获得高产生物表面活性剂菌株的一种有效手段。     

苏云金芽孢杆菌Ⅱ类转座因子的应用与研究进展

苏云金杆菌的转座因子分为两类：Ⅰ类,插入序列;Ⅱ类,转座子．在结构上,这些转座因子与苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（ICPs）基因相联系,并且这些具有转座活性的转座因子在ICPs基因的转移和变异上起着重要作用．对苏云金芽孢杆菌的Ⅱ类转座因子即转座子的结构、作用机制、应用与研究进展进行了综述．     

杆状病毒转座因子研究进展

转座因子(Transposable elements)是一类可移动转座的遗传因子的统称,包括原核生物中的插入(IS)、转座子(Tn)、质粒;真核生物中的Ty,P因子,2μDNA,Copia因子,以及噬菌体Mu和反转录病毒等。因此,转座因子又称可移动的遗传因子(Mobile genetic element)。转座因子最早由美国科学家Barbara McClintock于1956年在玉米染色体中发现,并于1984年被授予诺贝尔医学或生理学奖。转座因子的发现无论在理论上还是实践上都具有很重要的意义,被认为是遗传学发展史上的重要里程碑之一。杆状病毒是一类以节肢动物(主要发现于昆虫纲鳞翅目)为宿主的病毒的统称。杆状病毒亦存在转座因子。对杆状病毒转座因子的研究起源于对感     

用Tn3转座子作载体将指定DNA片段定向插入细胞染色体中的方法简介

导言:研究指出;无论是抗癌基因导入到染色体 DNA 的特定部位,还是一段破坏性序列插入到致癌基因中,都可以通过求助于转座子 Tn3而做到(X.C.Wang,1987,Arthur。1979,Reed.1981)。Tn3转座子,作为细菌中小的 DNA 分立结构而存在。当它被转移到其它细胞中时,它也可以复制其自身,新的拷贝还能“跳”到细胞 DNA 上,插入其中。结果或者发生复制子间转座过程,或者发生分子内转座过程。(Sherratt,1979)基于这样一种特点,可使它用于特定 DNA 片段的定向导入的实验体系中。     

通过转座诱变筛选甲基营养菌吡咯喹啉醌合成缺陷突变株

目的:对电转化等Tn5转座诱变条件进行优化,获得大量甲基营养菌MP688突变株,筛选吡咯喹啉醌(PQQ)合成缺陷突变株,并对失活基因进行鉴定。方法:通过电击方法对MP688株进行Tn5转座诱变;通过检测PQQ产量,选择不产或几乎不产PQQ的突变株,用质粒拯救的方法鉴定突变基因。结果和结论:确定了MP688株电击转化的最优条件,优化了质粒拯救法鉴定突变基因的实验方案,得到了1株PQQ合成明显降低的突变株RM16,并确定了转座子在染色体上的插入位点。     

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

转座子Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间转座功能互补与转座免疫的研究

Tn4(sm~rSu~rAp~r)、Tn3(Ap~r)与Tn233(CH)(Sm~rSu~rHg~r)是结构上相关而且都属于TnA家族的转座子。据报道Tn4中还含有一个拷贝的Tn3。为了弄清它们在家系中的关系,我们进行了Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间的转座功能互补与转座免疫的研究。结果如下:(1)当Tn4以反式状态存在时,Tn233(CH)转座功能缺失的tnpA~-变种(Ta233△E12)的转座能力可以恢复,但Tn3不能使之恢复;(2)Tn233(CH)能转座到质粒R144drd3::Tn4或R144drd3::Tn3上形成带二个转座子的质粒;(3)带二个转座子的质粒会失去二种不同转座子中的一种。当寄主细胞在无抗生素的营养培养基上移种5—15次后,仍带有二种转座子共存质粒R144drd3::Tn233::△E15::Tn233△B5的细胞的百分率只有8.3％;与此相比,在相同的情况下,带R144drd3::Tn4::Tn233(CH)的细胞的百分率为71.2—86.2％,带R144drd3::Tn3::Tn233(CH)的细胞的百分率为96.2％。