PCR技术研究进展

PCR(Polymerasechainreaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的最新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(MultiplexPCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(ElectronicPCR)的原理和应用 。     

Evaluation of PCR-based methods for isolating flanking regions of genes

Several polymerase chain reaction (PCR)-based methods are available for isolation of unknown genomic fragments. In the present study, a comparative evaluation of a few methods of ligation-mediated PCR methods and a ligation-independent one were made by isolating promoter fragment for N-methyltransferase gene involved in the caffeine biosynthetic pathway of Coffea canephora. The benefits of tertiary PCR and the effects of a 4-base cutting restriction endonuclease on the size of the PCR products obtained were demonstrated in one of the ligation-mediated PCR methods. The methods adopted in this study differed in the sizes of the 5'-flanking regions obtained. The efficiencies of various methods used reflect the inherent limitations of the PCR-based methods for isolation of unknown flanking regions.     

变性梯度凝胶电泳技术在微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳是不依赖于培养的、依据DNA分子的大小和所带电荷分析微生物多样性和动态变化的分子生物学技术,具有检测极限低、分析速度快及重复性好等优点。主要对变性梯度凝胶电泳原理、特点及其在微生物多样性应用方面进行综述。     

PCR在鸭瘟病诊断和免疫及致病机理研究中的初步应用

根据GenBank文献,应用Oligo 6.0分析软件合成了用于扩增鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)EcoRⅠ765bp片段的1对引物,上游引物(P1)位于EcoR Ⅰ片段的246～266nt,下游引物(P2)位于EcoRⅠ片段的727～744nt,以DPV CHa株DNA为模板,筛选PCR最佳反应条件,建立了检测DPV的PCR方法.应用该方法对强毒株DPV鸭胚培养物和弱毒株的鸡胚培养物进行扩增,均可获得498bp的DNA片段.而对正常鸭(鸡)胚和鸡马立克氏病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌和鸭疫里默氏杆菌培养物进行检测,结果均呈阳性.扩增产物测序结果与文献报道一致,证明了PCR方法的特异性.对DPV CHa株鸡胚毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为10fg.用病毒分离、Dot-ELISA和PCR三种方法分别检测1990～2002年期间送检的临床样品,对所获得的结果进行χ2分析,证明PCR检出率明显高于前2种方法.CHa株免疫雏鸭后对血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、肌肉、骨髓、食道共18种组织和粪便进行PCR检测,结果表明:①皮下接种4h后,心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑为阳性,8h后18种组织和粪便均为阳性;②口服接种4h后舌头和食道为阳性,8h后,心、肝、脾、肾、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、食道和血液均为阳性;③滴鼻接种4h后无阳性组织,8h后检测心、肝、脾、肾、胸腺、延脑、大脑、小脑、舌头、食道和血液,均为阳性;④三种途径免疫的鸭,于12h至第21天均检测出DPV DNA.DPV强毒SC1株人工感染成年鸭2h后,即能从脑、肝、脾、法氏囊和胸腺中检出DPV DNA.12h后和死亡鸭的心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、脑、胸肌、食道、腺胃、血液、舌头、皮肤、骨髓等组织器官和口腔分泌物及粪便中,均检测到DPV的DNA.该研究为阐明鸭瘟病毒在体内分布提供了重要的数据.     

一种简便高效的改良降落PCR

降落(touchdown,TD)PCR通常涉及15个退火温度,程序设计复杂。报道了一种简便高效的改良降落PCR,只需5个降落退火温度,以杜氏盐藻(Dunaliellabardawil)基因组为模板,设计一对引物扩增胡萝卜素生物合成相关(carotenebiosynthesisrelated,cbr)基因的第3外显子。实验证实该方法程序简单,比标准降落PCR步骤简化70%,且产物的特异性及效率都有较大提高。     

猪圆环病毒PCR检测方法的优化

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为无囊膜的单股负链DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒,大小约为17nm[1].PCV根据抗原性及基因组的不同可以分为PCV1和PCV2两种基因型,PCV 1分离自猪肾细胞系PK15,它不致病,能够在PK15中稳定存在而不形成细胞病变;PCV 2对猪有致病性,可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病.     

猪肌生成抑制素基因编码序列的分析

通过ＰＣＲ分段扩增出军牧１号白猪的肌生成抑制素基因编码序列１１２８ｂｐ,与国外猪种 同一基因的ｃＤＮＡ序列进行比较,仅在６３４ｂｐ处发生了由Ｔ替换Ｃ的变化,但对应的氨基酸没有变化,说明猪肌生成抑制素基因具有很高的保守性。     

四川地区阴道毛滴虫内人型支原体的PCR检测

从临床上分离获得20株阴道毛滴虫虫株,经纯化培养后,提取基因组DNA.以人型支原体16S rDNA序列设计特异性引物,利用PCR技术检测阴道毛滴虫内的人型支原体,结果有13株为人型支原体阳性,感染率为65%,表明阴道毛滴虫与人型支原体的共生关系在中国四川具有普遍性.     

深圳地区产超广谱β-内酰胺酶菌株的TEM基因分析

目的了解本地区临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)株携带TEM基因的情况.方法应用表型确证试验筛选产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌.碱裂解法提取产酶株的质粒,应用PCR方法分析TEM基因.结果215株产ESBLs菌株中TEM基因阳性87株,阳性率为40.5%,其中产酶大肠埃希菌TEM阳性率为49.7%,肺炎克雷伯菌阳性率为18.8%.TEM型产酶株主要来源于痰和尿标本(37.9%和22.0%),在肝胆外科、重症监护室和老年病科分布较多.结论TEM型为本地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常见的基因型,广泛分布于各临床科室,需引起重视.     

FMR-1基因中CGG重复序列扩增条件的优化

目的:优化PCR扩增条件,建立一种有效检测脆性X综合征的方法。方法:在常规PCR的基础上,采用耐高温酶替代法、碱基替代法,同时加入有机溶剂DMSO等,对表型正常的人群进行FMR1基因CGG重复序列检测。结果:改良PCR法可以提高G C富集区扩增效率,并取得了较好的效果。结论:建立了一种扩增FMR-1基因中CGG重复序列的可行方法。     

PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌于菌体外,另一种结合在菌体表面,它们能使含有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶（Coagulase）。凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。试验根据GenBank公布的血浆凝固酶序列,设计特异PCR引物,利用聚合酶链式反应扩增出金黄色葡萄球菌凝固酶基因,克隆测序,与Genbank中已公布的序列同源性达到100％,并且检测结果与用兔血浆进行血浆凝固酶实验结果完全吻合,建立了金黄色葡萄球菌性乳腺炎的快速诊断方法。     

用PCR法快速半定量阴道分泌物中的乳酸杆菌

目的 通过对PCR引物、反应条件及样本处理条件的摸索,建立一种不经过分离培养和DNA提取纯化步骤,直接用乳酸杆菌特异性引物快速定性、半定量妇女阴道分泌物标本中乳酸杆菌的方法.方法 设计乳酸杆菌属特异性引物;对样本处理方法和PCR反应条件进行摸索;比较用PCR法定量阴道分泌物中乳酸杆菌的结果和稀释滴种法定量结果的相关性.结果 （1）用浓度为2%的Tritonx-100处理阴道标本后可在220 bp的位置得到最佳的特异性扩增区带;（2）将MgCl2在PCR反应体系中的终浓度调节至2.5 mmol/L时,可以产生最强的特异性反应扩增带;（3）用PCR法分析阴道分泌物所得菌数与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）;用PCR法分析阴道分泌物所得灰度值与培养所得菌数之间明显相关（P＜0.05）.结论 将阴道分泌物标本经过简单的离心、洗涤处理后,直接应用PCR法,就可以快速地定性和半定量妇女阴道分泌物标本中的乳酸杆菌.     

茎尖嫁接脱除柑橘黄龙病病原及其检测方法比较

运用茎尖微芽嫁接技术脱除柑橘黄龙病病原,并采用PCR技术和直接荧光法对脱毒后的植株进行脱毒效率检测。结果表明,茎尖微芽嫁接成活率最高为75%;茎尖微芽嫁接技术是脱除黄龙病病原的一种有效方法,脱毒率达100%,脱毒后均检测不到病原存在;PCR技术检测病毒的检出率为100%,而直接荧光法的检出率仅为33.3%,说明PCR技术具有更高的灵敏度。     

PCR快速分析水稻cDNA文库构建质量方法的简化

对由水稻cDNA文库铺成平板的噬菌斑,采用tip吸头穿刺噬茵斑后在PCR反应混合液中吸打2次,直接作为PCR扩增模板进行PCR反应和电泳分析的方法,可以达到快速、简便地分析水稻cDNA文库构建的质量.此法无需提取噬茵斑DNA作为PCR扩增模板,操作简单、方便、快捷.     

云南美味牛肝菌ITS区域结构特点

利用ITS的通用引物（ITS5-ITS4）对云南的美味牛肝菌（Boletus edulis）子实体的DNA进行PCR扩增,扩增产物回收后直接测序。序列的聚类分析表明,在ITS1—5．8S rDNA-ITS2区域,云南的美味牛肝菌与欧洲的夏牛肝菌（B．aestivalis）和铜色牛肝菌（B．aereus）同源性较高,但在ITS2区域夏牛肝菌和铜色牛肝菌分别有一段美味牛肝菌没有的大小分别为73bp和26bp的特征序列。     

应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展

各种建立在PCR基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种：反向PCR的方法,连接法介导的PCR的方法以及特异引物PCR的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。     

红色毛癣菌菌株的特异性PCR鉴定方法研究

目的建立一种快速的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法。方法根据红色毛癣菌保守区域-真菌核糖体DNA（rDNA）的转录间隔区（ITS）设计特异性引物,采用上游：ITS19865＇GAC ACC AAG AAA AAA TTC TCT GAA GA3＇,下游：ITS24415＇GTC CTG AGG GCG CTG AA3＇为引物对45株红色毛癣菌、5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌菌株的DNA进行PCR扩增,观察产物电泳带型的差异。结果 45株红色毛癣菌均能扩增出目的片段,5株须癣毛癣菌和1株紫色毛癣菌均无目的片段扩增出。结论红色毛癣菌可用特异引物PCR方法快速鉴定。     

凹甲陆龟沙门氏菌的分离鉴定及毒力因子基因的PCR检测

从成都动物园因腹泻死亡的凹甲陆龟体内分离到一株病源菌,经选择性分离培养、生化试验、血清型鉴定等,确定该病源菌为D群肠炎沙门氏菌,其抗原结构式为1,9,12∶ g,m∶ -.该菌株对小鼠有较强的致病性,能引起人工感染小鼠大量死亡,且从其体内分离到相同特性的菌株;药物敏感性试验证实该分离菌对头孢曲松、氧氟沙星、卡拉霉素、多粘菌素、复方新诺明、呋喃唑酮等敏感,对链霉素、四环素、氯霉素等耐药;同时根据GenBank中已报道的沙门氏菌毒力因子ivnA和ivnE的基因序列,设计两对特异性引物对该菌进行PCR检测,结果在该菌中成功扩增并检测出ivnA和ivnE基因.本试验尝试了沙门氏菌的PCR检测方法,为该分子诊断技术的全面推广奠定了良好基础,也为今后该疾病的预防、诊断和治疗提供了科学的实验数据.