伪狂犬病病毒上海株gE-/gI-/GFP+缺失株的生物学特性初步研究

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体pgEI-GFP基础上,将pgEI-GFP转染感染了PRV-SH株的BHK-21细胞,待出现80%以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE-/gI-/GFP+缺失株.研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性.试验结果显示,缺失了gE-和gI-后,不影响其在RK细胞上的生长状况和病毒的滴度.该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降.该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量PRV-SH株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组.该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体.     

伪狂犬病病毒上海株gE^-／gI^-／GFP^＋缺失株的生物学特性初步研究

在构建了伪狂犬病病毒上海株的缺失载体pgEI-GFP基础上,将pgEI-GFP转染感染了PRV-SH株的BHK-21细胞,待出现80％以上的细胞病变时收获病毒,并以绿色荧光蛋白为标志,通过蚀斑法得到纯化重组病毒gE^-／gI^-／GFP^ 缺失株。研究了该缺失株的的安全性、在细胞上的生长特性以及对断奶仔猪的安全性、免疫原性等生物学特性。试验结果显示,缺失了gE^-和gI^-后,不影响其在RK细胞上的生长状况和病毒的滴度。该疫苗株对小鼠的半数致死量比亲本毒低且对家兔的致死性的时间延长了,这表明该疫苗的毒力比亲本毒有所下降。该缺失株对断奶仔猪安全,无不良接种反应,接种断奶仔猪能抵御高剂量PRV-SH株强毒的感染,攻毒后试验猪的发热期、散毒天数均低于对照组。该缺失株接种仔猪后在试验期间一直维持较高水平的中和抗体。     

伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)gE-/gI/GFP+缺失株的构建

在构建了含伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上,采用酶切的方法构建了载体pgEI。然后用限制性内切酶BamHI和BstpI缺失掉gE基因5'端363bp,同时把绿色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分,并在下游引入一个多克隆位点,构建了缺失转移载体pgEIGFP。用DOTAP转染试剂盒将pgEIGFP转染了感染PRVSH的BHK21细胞,待出现80%病变后收获病毒,并以蚀斑法得到纯化的缺失了gE/gI重组病毒株。小鼠试验证实了缺失株的毒力有所下降。     

Ⅰ型牛疱疹病毒TK-/gE-基因双缺失突变株生物学特性

目的构建Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,检测其生物学功能,为治疗牛传染性鼻气管炎提供参考。方法构建了带有EGFP表达盒的BHV-1 TK-/gE-双缺失突变株。通过southern杂交、蛋白质斑点印迹、空斑试验、MDBK细胞增殖实验等技术方法,对重组基因所构成病毒突变株的生物学特性进行鉴定。结果 Southern杂交及蛋白斑点印迹表明,课题组成功构建了带有EGFP表达盒的双缺失突变株;该突变株具有与野生株相当的繁殖力,但TK-/gE-成功缺失,毒力大幅减弱;BHV-1 TK-/gE-遗传稳定,不会返强。结论本项目组成功构建了Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-1）的TK-/gE-双缺失突变株,该缺失株具有良好的安全性和稳定性,为该突变株进一步作为生物安全疫苗和多价病毒载体提供了依据,为预防和治疗牛传染性鼻气管炎提供了技术支持。     

伪狂犬病病毒Ea株TK-/gE-/gp63-突变株的构建及其生物学特性研究

伪狂犬病病毒 (ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ,ＰＲＶ)属疱疹病毒科 ,具有在细胞培养物上快速生长、强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性。本病毒可感染多种家畜和野生动物 ,对养猪业的经济损失最大。伪狂犬病对养猪业的危害主要表现在 :(1 )母猪流产 ,产死胎、木乃伊胎 ,临床以产死胎为主。 (2 )新生仔猪大量死亡 ,1 5日龄以内仔猪死亡率为 1 0 0 %。 (3 )断奶仔猪发病死亡 ,表现为拉稀 ,作划水样或转圈运动 ,口吐白沫、阵挛性痉挛及强性痉挛和搔痒等症状。 (4)引起种猪不育。公猪发生睾丸肿胀、萎缩 ,失去种用能力。母猪表现为不发情…     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-／gG^-／LacZ^ 突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-／gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb／c小鼠极为安全且能保护Balb／c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

Oka株水痘病毒的生物学特性研究

将日本大阪大学微生物病研究会（BIKEN）提供的Oka水痘病毒第28代减毒株,通过MRC－5人二倍体细胞连续传递10代,建立主代及工作代毒种批,并对其后的32代,34代,36代及38代病毒按WHO规程进行全面检定,证实其生物学特性相似,免疫原性良好,确保制备水痘减毒活疫苗毒种的稳定性和一致性。     

伪狂犬病病毒TK-/gG-缺失株的构建及其生物学特性研究

将伪狂犬病病毒TK^-/gG^-/LacZ⁺突变株的基因组DNA与含有缺失的gG基因的转移质粒pUSKBB共转染猪肾传代细胞PK-15,待完全病变后收获病毒进行空斑试验,用PCR筛选gG缺失的重组病毒。空斑纯化3次后,随机挑取空斑进行PCR扩增,证实所获得的病毒为均一的TK^-/gG^-缺失株。遗传稳定性试验表明该重组病毒能在PK-15细胞上稳定遗传,动物试验表明该缺失株对Balb/c小鼠极为安全且能保护Balb/c小鼠抵抗致死量PRV强毒的攻击。该突变株的获得为我国伪狂犬病的控制和根除奠定了基础。     

伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究

本试验通过对PRV基因缺失株SA215(gE-/gI-/TK- )细胞培养特性、理化特性及形态发生过程进行研究,来确定gE、gI和TK 基因缺失对病毒特性的影响。结果表明,基因缺失对该毒株在培养细胞的吸附和穿入过程没有影响,但与亲本株相比,表现为生长掩蔽期延长,增殖速度减缓,但能达到相似的增殖滴度,并且基因缺失对病毒的理化特性影响很小。形态发生过程观察结果表明,PRV SA215 株在细胞培养上形态发生正常,能形成感染性病毒粒子,但在由核膜出芽和囊膜形成上受到一定程度的阻碍。本研究为疫苗研制和生产提供指导和依据。     

伪狂犬病病毒基因缺失疫苗制苗用毒种特性研究

本试验通过对PRV基因缺失株SA215(gE -/gI -/TK -)细胞培养特性、理化特性及形态发生过程进行研究,来确定gE、gI和TK基因缺失对病毒特性的影响.结果表明,基因缺失对该毒株在培养细胞的吸附和穿入过程没有影响,但与亲本株相比,表现为生长掩蔽期延长,增殖速度减缓,但能达到相似的增殖滴度,并且基因缺失对病毒的理化特性影响很小.形态发生过程观察结果表明,PRV SA215株在细胞培养上形态发生正常,能形成感染性病毒粒子,但在由核膜出芽和囊膜形成上受到一定程度的阻碍.本研究为疫苗研制和生产提供指导和依据.     

伪狂犬病基因缺失疫苗的研究进展

伪狂犬病是由疱疹病毒科伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物的一种急性传染病.动物感染后表现为从隐性临床症状到严重的呼吸道和神经症状综合症.该病给世界养猪业造成巨大的损失,目前预防该病主要是以疫苗接种为主.综述了当今广泛应用的伪狂犬病基因缺失疫苗的研究现状和进展.     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验、耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交叉血抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减少中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒。其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

云南辛德毕斯病毒的生物学性状研究

本文对云南首次分离到的Sindbis病毒进行了滤过试验,耐酸耐醚试验、致细胞病变、动物敏感性试验、血压 凝特性、空斑和毒力等试验研究,结果符合披膜病毒科的病毒特性。交 因抑试验和免疫荧光试验,以及空斑减小中和试验进一步证实为甲病毒属的Sindbis病毒,其空斑纯化株的生物学特性也与原株相符,纯化株的制备为该株病毒分子生物学研究的准确性和一致性提供了条件。云南Sindbis病毒的首次分离具有重要的流行病学意义,其生物学特性研究结果对我省该病的诊断和防治具有重要的指导意义。     

伪狂犬病毒gD基因转化马铃薯的初步研究

以可直接饲用的马铃薯作为伪狂犬病病毒糖蛋白基因gD的表达植物,探索用马铃薯茎段作为外植体的再生体系和遗传转化体系.结果表明:添加2 mg/L ZT和0.1 mg/L NAA的MS培养基,可使马铃薯茎段愈伤组织诱导率达70%,出芽率达38%;添加0.5 mg/L的硝酸银可明显减少愈伤组织在继代过程中的褐化程度,并且促进其分化.在农杆菌的菌液OD_(600)值为0.1～0.2,侵染茎段1 h,共培养3 d的条件下转化效果最好,抗性愈伤率达到52.3%.实验共获得21株转化植株,挑选7株进行RT-PCR检测,结果证明gD基因已被整合到马铃薯基因组中.     

鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV) gH、gE基因的序列, 设计了两对引物及其对应的TaqMan探针, 通过对引物、探针、Mg2+的浓度和样品DNA提取方法等进行优化, 建立了鉴别PRV野毒与疫苗毒感染的荧光定量PCR方法。该方法线性范围为101~108拷贝/mL, 达8个数量级, 灵敏度可达101拷贝/mL, 比常规PCR高100倍。用此方法对60份疑似组织样品进行检测, 并与血清中和试验、常规PCR相比较, 结果显示该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点, 并且该法以闭管的模式操作, 减少了后续步骤污染的可能性, 整个PCR检测过程不到2 h。此方法的建立, 为猪伪狂犬病病毒的早期鉴别诊断和定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。