朱砂叶螨几丁质合成酶基因1全长cDNA的克隆与表达分析

【目的】克隆朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质合成过程中的关键酶几丁质合成酶基因,并检测该基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【方法】本研究采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及c DNA末端快速扩增(RACE)技术首次克隆获得朱砂叶螨几丁质合成酶基因1的全长c DNA序列(命名为Tc CHS1,Gen Bank登录号为KM242062),并使用实时荧光定量PCR技术首次检测了Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育不同阶段的相对表达量。【结果】朱砂叶螨Tc CHS1基因的c DNA全长为4 881 bp,包括198 bp的5'非翻译区(5'-UTR),4 425 bp的开放阅读框(ORF),258 bp的3'非翻译区(3'-UTR),开放阅读框编码1 474个氨基酸,预测其蛋白质分子质量约为168.35 ku,理论等电点为6.26。其包含EDR和QRRRW这2个几丁质合成酶基因的标签序列。氨基酸序列同源性分析结果表明:Tc CHS1与其他昆虫该基因编码蛋白的氨基酸序列相似度在50%左右,与二斑叶螨Tetranychus urticae的氨基酸相似度最高(98%),与西方盲走螨Metaseiulus occidentalis的相似度为55%。分子系统进化的结果也表明Tc CHS1与其他昆虫的CHS1聚在一起,并且和二斑叶螨具有最近的亲缘关系。荧光定量分析表明Tc CHS1基因在朱砂叶螨生长发育的不同阶段(卵、幼螨、第1若螨、第2若螨、雌成螨和雄成螨)均有表达,在卵和雌成螨中的表达量较高,在第2若螨的表达量最低。【结论】Tc CHS1基因可能在朱砂叶螨生长发育过程中具有重要作用。     

球毛壳菌（Chaetomium globosum）过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白（pero）基因片段（GenBank Accn:BP099709）为基础,用RACE 技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3′RACE产物和508bp的5′RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17.5kD,理论等电点为5.75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明：该基因与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高（83%）。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kD处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符,说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。     

日本蟳高血糖激素基因的克隆与表达分析

通过RACE技术克隆获得日本蟳Charybdis japonica高血糖激素基因（CjCHH）全长cDNA序列;运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析该基因的组织差异性表达;利用原核表达技术获得CjCHH重组蛋白。序列分析表明：CjCHH cDNA全长1754 bp,包含111bp的5’末端非编码区（UTR）,423 bp的开放阅读框（ORF）,以及1236 bp的3’UTR,该基因可编码140个氨基酸。序列比对结果显示：CjCHH的成熟肽序列与其它甲壳动物CHH的一致性为41%~88%。系统进化树显示：CjCHH与其它梭子蟹科的CHH聚在一起,这与日本蟳所处的分类地位一致。组织差异性表达研究显示：CjCHH在检测的10个组织中均有表达,其中眼柄中表达量最高,肠和Y-器次之,其余组织表达量较低。成功构建了CjCHH重组表达质粒pET-CHH,并在大肠杆菌（Escherichia coli）中获得了高效表达,重组蛋白的相对分子量约11 kDa,与预测的相对分子质量大小相一致,表达水平在5 h的IPTG诱导过程中呈现上升趋势。     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

二化螟热休克蛋白70基因的克隆及热胁迫下的表达分析

热休克蛋白70是已知热休克蛋白家族中最重要的一种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫的耐受性。为探讨热胁迫对二化螟Chilo suppressalis幼虫热休克蛋白70表达的影响, 采用RT-PCR及RACE技术从二化螟血淋巴细胞中克隆了热休克蛋白70基因全长cDNA序列。该基因全长2 102 bp, 开放阅读框 (open reading frame, ORF)为1 959 bp, 编码652个氨基酸; 5′非编码区（untranslated region, UTR)为81 bp, 3′UTR为62 bp。从该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫的同源序列比较有很高的相似性（73%~97%)。实时定量PCR显示二化螟HSP70基因能被热胁迫诱导表达, 幼虫血淋巴细胞的HSP70基因在36℃时表达量最高。流式细胞术研究发现HSP70在蛋白质水平上的表达变化与在mRNA水平上高度一致, 说明二化螟HSP70基因在转录及翻译水平上受到热应激的调节。     

牛催乳素基因组及其cDNA全长序列的分子克隆和分析

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长9388bp的牛催乳素（bPRL)基因组序列（GenBank登录号AF426315）,其中包括bPRL基因全部5个外显子和4个内含子,5′端854bp的上游调控区以及3′端69bp的UTR,AF426315基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAL28075,由229个氨基酸残基组成,1-30位氨基酸残基为信号肽序列,成熟的多肽含有199个氨基酸残基,将bPRL基因组DNA真核表达载体转染COS-7细胞后通过RT-PCR得到长度为804bp的bPRLcDNA序列,该序列涵盖了bPRL基因的全部ORF区,证明本研究所获得的bPRL基因组DNA具有转录的生物学功能,Blast搜索结果显示,GenBank数据库中收集有多条bPRL基因的mRNA和EST序列,各序列间存在多个SNP位点,主要分布于下游编码区和3′端的UTR,这些位点均未改变相应的氨基酸残基的性质,此外,5′端编码信号肽序列的区域呈现高度保守性。     

异色瓢虫HSP67B2基因的克隆及诱导表达分析

小分子热激蛋白是一种重要的分子伴侣,可以在环境胁迫下帮助蛋白质折叠和转运。本研究在转录组获得异色瓢虫 Harmonia axyridis HSP67B2基因部分序列的基础上,通过RACE技术克隆得到了 HSP67B2 基因的 cDNA 全长序列（基因登录号：KJ155728）,全长626 bp,其中编码140个氨基酸,3′非翻译区为 81 bp,5′非翻译区为122 bp,软件分析预测显示该基因编码蛋白的分子量为1597 kD,理论等电点为661。采用荧光定量 PCR 技术对异色瓢虫 HSP67B2基因在不同发育阶段、低温诱导条件和饥饿处理下的表达进行了研究,结果表明：HSP67B2 基因在幼虫期的表达量最高;在低温诱导和饥饿处理下,HSP67B2 基因出现上调表达并且表达效率显著提高,表明HSP67B2 基因可以通过调控小分子热激蛋白的合成使异色瓢虫适应环境变化。      

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个新的金属硫蛋白基因LbMT2全长cDNA序列。该基因全长518 bp, 其中5′非翻译区(UTR)64 bp, 3′非翻译区205 bp, 开放阅读框(ORF)249 bp, 编码由82个氨基酸组成的蛋白质, 编码蛋白的分子量为8.1 kDa, 理论等电点(pI)为4.72。利用实时定量PCR方法研究了二色补血草在CuSO4、CdCl2、NaCl、低温和PEG胁迫下不同时间该基因的表达模式。结果表明, CuSO4、CdCl2、NaCl和低温处理均能诱导LbMT2基因在二色补血草的根和叶中的表达, 而PEG处理则抑制了LbMT2在根和叶中的表达。构建LbMT2基因的原核表达载体pGEX-LbMT2, 通过IPTG诱导在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21中融合表达, SDS-PAGE 电泳获得35 kDa 的蛋白条带, 大小与预期相符。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

B型烟粉虱和温室白粉虱热激蛋白90基因（hsp90）的全长cDNA克隆与系统发育分析

B型烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) biotype B和温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum均为全球普遍发生的重要害虫。本研究以其他昆虫热激蛋白90基因（hsp90）保守区域设计兼并引物扩增两种粉虱hsp90中间片段, 然后利用RACE技术获得全长cDNA。温室白粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2 166 bp, 编码722个氨基酸; 烟粉虱hsp90全长cDNA的开放性阅读框2 160 bp, 编码720个氨基酸。两种粉虱HSP90的完整氨基酸序列相似性高达92.94％, 并均具有定义HSP90家族签名序列的5个氨基酸保守区域和末尾基序“MEEVD”。通过real-time PCR技术, 探测到两个基因在mRNA水平上皆能高温诱导表达。采用昆虫纲所有完整HSP90氨基酸序列进行Kimura双参数遗传距离分析并构建NJ进化树, 结果显示hsp90在昆虫纲低级阶元水平和高级阶元水平系统进化上能得到一个较理想结果。本研究结果为B型烟粉虱和温室白粉虱抗逆适应性研究提供基础, 并进一步验证保守的功能基因hsp90可以作为研究生物系统发育的手段之一     

Cloning and expression of HSP70 gene of sipuncula Phascolosoma esculenta

In this study the gene encoding HSP70 was isolated from Phascoloma esculenta by homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends (RACE). The full-length of cDNA (2520 bp) consists of a 5′-terminal untranslated region (UTR) (125 bp), a 3′-terminal UTR (421 bp) with a canonical polyadenylation signal sequence (AATAAA), a poly (A) tail, and an open reading frame (ORF) (1974 bp). The predicted molecular mass and isoelectric point for HSP70 is 71.6 kDa and 5.15, respectively. BLAST analysis showed that P. esculenta HSP70 gene shared high similarity. Classical HSP signature motifs, ATP/GTP-Binding Site Motif A, Bipartite Nuclear Targeting Sequence, the cytosolic HSP70 could be expressed in Escherichia coli BL21. After purification, the recombinant pET-HSP70 protein was used to produce the polyclonal antibody in mice and the specificity of the antibody was confirmed by Western blot analysis. Fluorescent real-time quantitative PCR analysis showed that expression of Hsp70 in sipuncula was increased significantly after exposure to 10 mM Zn for12 h, Cd for 24 h, Cu for 48 h, and was exposure to 37 °C for 24 h sea water.     

MOLECULAR CHARACTERIZATION OF THE LECTIN,BRYOHEALIN, INVOLVED IN PROTOPLAST REGENERATION OF THE MARINE ALGA BRYOPSIS PLUMOSA (CHLOROPHYTA)1

When a coenocytic cell of the green alga Bryopsis plumosa (Hudson) C. Agardh was cut open and the cell contents expelled, the cell organelles agglutinated rapidly in seawater to form protoplasts. This process was mediated by a lectin, Bryohealin. The full sequence of the cDNA encoding Bryohealin was obtained, which consisted of 1,101 base pairs (bp), with 24 bp of 5′ untranslated region (UTR) and 201 bp of 3′ UTR. It had an open reading frame (ORF) of 771 bp encoding 257 amino acid residues. A signal peptide consisted of 22 amino acids presented before the start codon of Bryohealin, indicating that this lectin was a vacuolar (storage) protein. The C‐terminal sequence of Bryohealin was composed of antibiotic domains, suggesting that this lectin could perform two functions: (i) aggregation of cell organelles in seawater and (ii) protection from bacterial contamination for successful protoplast regeneration. The BLAST search result showed that Bryohealin had little sequence homology with any known plant lectins, but rather resembled animal lectins with fucolectin domains. The expression of recombinant Bryohealin (rBryohealin) was obtained in the Escherichia coli system.     

Cloning and characterization of hemerythrin gene from Sipuncula Phascolosoma esculenta

Hemerythrin is a non-heme respiratory protein involved in oxygen storage and transport in invertebrates. In the present study, the hemerythrin cDNA was cloned from Phascolosoma esculenta (denoted as PeHr) by PCR and rapid amplification of cDNA ends approaches. The full-length PeHr consisted of 770 bp containing of a 5′-terminal untranslated region (UTR) of 83 bp, a 3′-terminal UTR of 327 bp, and a coding domain sequence of 360 bp encoding a polypeptide of 120 amino acids with estimated molecular mass of 13.6 kDa and theoretical isoelectric point of 5.78. The expression profiles of PeHr were evaluated by real-time RT-PCR under blood loss stress. The expression level of PeHr was significantly up-regulated from 45 to 48 h, then slightly recovered to its original level. The coding sequence of the PeHr was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) for antibodies preparation. Western blotting analysis conformed that the generated antibodies could specifically identify not only recombinant product, but also native protein from the total protein extraction. Our results indicated that PeHr might be involved into haemocytes regeneration, and its function roles should be further investigated by the generated antibodies.     

Cloning and expression analysis of a HSP70 gene from Pacific abalone (Haliotis discus hannai)

Heat shock protein 70 (HSP70), the primary member of HSPs that are responsive of thermal stress, is found in all multicellular organisms and functions mostly as molecular chaperon. The inducible HSP70 cDNA cloned from Pacific abalone (Haliotis discus hannai) using rapid amplification of cDNA ends (RACE), was highly homologous to other HSP70 genes. The full-length cDNA of the Pacific abalone HSP70 was 2631bp, consisting of a 5'-terminal untranslated region (UTR) of 90bp, a 3'-terminal UTR of 573bp with a canonical polyadenylation signal sequence AATAAA and a poly (A) tail, and an open reading frame of 1968bp. The HSP70 cDNA encoded a polypeptide of 655 amino acids with an ATPase domain of 382 amino acids, the substrate peptide binding domain of 161 amino acids and a C-terminus domain of 112 amino acids. The temporal expression of HSP70 was measured by semi-quantitative RT-PCR after heat shock and bacterial challenge. Challenge of Pacific abalone with heat shock or the pathogenic bacteria Vibrio anguillarum resulted in a dramatic increase in the expression of HSP70 mRNA level in muscle, followed by a recovery to normal level after 96h. Unlike the muscle, the levels of HSP70 expression in gills reached the top at 12h and maintained a relatively high level compared with the control after thermal and bacterial challenge. The upregulated mRNA expression of HSP70 in the abalone following heat shock and infection response indicates that the HSP70 gene is inducible and involved in immune response.     

烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达

利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从烟夜蛾Helicoverpa assulta (Guenée)雌虫卵巢中扩增得到了组织蛋白酶B酶原基因（cathepsin B,CB）cDNA片段,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明, 该片段长度为1 017 bp,含有组织蛋白酶B酶原基因完整开放阅读框架（ORF）（GenBank登录号：EF154237）。序列分析结果显示：烟夜蛾组织蛋白酶B（HassCB）编码338个氨基酸残基,预测N-末端含有长度为21个氨基酸残基的信号肽序列;去除信号肽序列后,预测成熟蛋白分子量为35.5 kDa,等电点为5.96。氨基酸序列比对结果表明,HassCB与其他昆虫的组织蛋白酶B酶原氨基酸序列有较高的一致性。将去除信号肽序列的HassCB（HassCBa）重组到表达载体pGEX-4T-1中,并转入原核细胞中表达,SDS-PAGE和Western印迹分析表明：该基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条大约61 kDa的目的条带,与预测的融合蛋白分子量相符。用该基因制备多克隆抗体并测得该抗体对重组表达的HassCBa的效价为1∶51 200。通过免疫印迹检测证实,此抗体既能识别重组表达的HassCBa,又能识别烟夜蛾卵巢匀浆液中的HassCB。     

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1 372 bp,开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175 bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。