基因工程在氨基酸产生菌中的研究进展

氨基酸与人类和饲养动物生长发育,关系甚为密切。在食品工业与医药工业中是一个重要的生产品种,年消耗量很大,所以每年都要大量生产(见表1) 目前,需求量大的谷氨酸,赖氨酸等,都是采用发酵法生产,所用的菌株大多是棒状杆菌属和短杆菌属中的菌株。由于这两类菌没有杂交系统,所以菌株的改良,产量的提高只有依靠诱变与筛选。近几年来,随着分子生物学,尤其是基因工程方法的发展,为了提高氨基酸产量,在这二类菌中也开展这方面的工作。本文就这方面的研究情况,作一简明的介绍。     

代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌合成及分泌途径生产L-缬氨酸

谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-缬氨酸的主要工业菌株。文中首先在谷氨酸棒状杆菌VWB-1中敲除了alaT (丙氨酸氨基转移酶),获得突变菌株VWB-2,作为出发菌株。进而对L-缬氨酸合成途径关键酶——乙酰羟酸合酶 (ilvBN) 的调节亚基进行定点突变 (ilvBN1M13),解除L-缬氨酸对该酶的反馈抑制。然后辅助过量表达L-缬氨酸合成途径关键基因ilvBN1M13、乙酰羟酸异构酶 (ilvC)、二羟酸脱水酶 (ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶 (ilvE),加强通往L-缬氨酸的碳代谢流,提高菌株的L-缬氨酸水平。最后,基于过量表达L-缬氨酸转运蛋白编码基因brnFE及其调控蛋白编码基因lrp1,提高细胞的L-缬氨酸转运能力。最终获得工程菌株VWB-2/pEC-XK99E-ilvBN1M13CE-lrp1-brnFE在5 L发酵罐中的L-缬氨酸产量达到461.4 mmol/L,糖酸转化率达到0.312 g/g葡萄糖。     

谷氨酸棒状杆菌技术研发态势分析

利用美国Thomson公司旗下的Thomson Data Analyzer和微软公司的Excel等分析工具,从时间、地域、专利权人、技术领域等方面,对德温特专利数据库中全球谷氨酸棒状杆菌领域专利的生命周期、区域布局、竞争机构和技术趋势进行了分析。以期为谷氨酸棒状杆菌技术发展态势提供情报支持,辅助企业、高校制定和调整技术发展战略、完善技术发展布局,在当今激烈的市场竞争环境下保持较高的技术优势。     

谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。     

产丁二酸谷氨酸棒状杆菌基因缺失代谢工程菌株的构建

【目的】提高谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032厌氧条件下的丁二酸产量,并降低发酵产物中副产物的含量。【方法】以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌,首先敲除乳酸形成的关键酶乳酸脱氢酶基因(ldh),构建ldh缺失株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh;然后以缺失株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh为出发菌,敲除该菌的丙酮酸脱氢酶系的E1p酶基因(aceE),构建一株双缺失突变菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC13032ΔldhΔaceE。【结果】与供试菌比较,谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh的丁二酸产量和转化率分别提高了94.9%和32%,并且主要的副产物乳酸产量由出发菌产量的63.5 g/L降低到很微量的程度。丙酮酸脱氢酶的失活并不能完全消除副产物乙酸的形成,但乙酸的产量较ATCC13032Δldh降低了37.9%,丁二酸的产量略有提高。【结论】该重组菌具有较强的丁二酸生产工业化潜力,并且该研究方法为微生物代谢育种提供参考。     

L-谷氨酸生产关键技术创新与产业化应用

L-谷氨酸是目前产量最大的氨基酸品种,也是我国生产规模最大的生物发酵产品。随着合成生物技术以及新型生产装备和技术的发展,国内L-谷氨酸菌种和生产技术近年来取得了明显的提升。本文从L-谷氨酸产业的现状分析和关键技术创新需求的角度出发,概述了L-谷氨酸菌种和生产技术的研究进展,介绍了近年来L-谷氨酸生产关键技术的创新开发和产业应用的进展。     

氨基酸生产的代谢工程研究进展与发展趋势

氨基酸发酵是我国发酵工业的支柱产业,近年来,随着代谢工程的快速发展,氨基酸的代谢工程育种蓬勃发展。传统的正向代谢工程、基于组学分析与计算机模拟的反向代谢工程以及借鉴自然进化的进化代谢工程,都有越来越多的应用。在氨基酸的工业生产中涌现出了一系列具有高效生产、抗逆性强等优良性状的菌株。日益剧烈的市场竞争对菌株的选育提出了新的要求,如开发高附加值氨基酸品种、菌株代谢的动态调控、适应新工艺的要求等。文中介绍了氨基酸生产相关的代谢工程研究进展以及未来的发展趋势。     

生物法合成戊二胺研究进展

随着经济快速发展,大气污染和全球变暖的趋势日益恶化。世界上每年消耗大量石化资源来源的聚酰胺,戊二胺作为聚酰胺的重要组成单体,生物法合成戊二胺具有经济学和生态学双重意义。目前,生物法合成戊二胺的工程菌主要有谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌,文中从微生物中戊二胺的代谢、戊二胺合成途径的关键酶和转运蛋白、戊二胺生产最佳代谢途径和戊二胺产量的预测、代谢工程研究进展等方面综述了生物法合成戊二胺的最新研究现状和进展,并对其前景进行了展望。     

谷氨酸棒杆菌metX、dapA基因敲除对苏氨酸合成的影响

谷氨酸棒杆菌中metX基因编码蛋氨酸合成途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶,dapA基因编码赖氨酸合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合成酶。为研究这两个基因缺失对苏氨酸积累的影响,以谷氨酸棒杆菌R102(AHVr)为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建了metX、dapA单基因缺失突变株R102ΔmetX、R102ΔdapA以及双基因缺失的突变株R102ΔmetXΔdapA。对出发菌以及上述3株重组菌进行初步摇瓶发酵试验,用HPLC法测定发酵液中苏氨酸含量。结果表明,发酵72 h后,3株重组菌的苏氨酸产量分别为2.58、2.38和3.01 g/L,比原始菌株分别提高了42.5%、31.5%和66.3%。     

干扰素和干扰素基因工程研究动向

当代人类所面临最严重的疾病--癌症和某些病毒病特别是潜伏性病毒病。据报导美国每年有40万人死于癌症,每四人当中有一人患不明病因之症,死于癌症牺牲者占这种病的2/3,有谓人类“头号敌人”之称。潜伏性慢病毒病也是一种最辣手的难题,因为这种病一旦发生,生命是无法挽救的,为制服这类病症所需药物之供应是一项最紧     

谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件

考察谷氨酸棒状杆菌ATCC13032Δldh厌氧产丁二酸的发酵条件。结果发现:补加NaHCO3的效果最好,并且考察了NaHCO3浓度对葡萄糖转化速率及丁二酸生成速率的影响。运用代谢流分析方法分析了乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢的影响,发现乳酸脱氢酶基因敲除导致磷酸烯醇式丙酮酸生成丁二酸的流量提高了214.3%,流向乳酸的流量变为0;分批厌氧转化36 h生成41.2 g/L丁二酸,产率45.0%。     

利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L 苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。     

基因敲除提高大肠杆菌工程菌生产异丁醇产量的研究

探究pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株对大肠杆菌工程菌发酵生产异丁醇的影响。运用Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113的pflB、frdAB、fnr和AdhE基因,构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株E.coliBW25113H,结合本实验室已经构建的表达质粒pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA,并检测该工程菌在1L发酵罐的发酵过程中的生物量、突变菌株的稳定性、异丁醇产量及有机酸含量的变化情况。成功获得pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H。发酵结果表明,该工程菌能以较长时间,较高比生长速率保持对数生长期,其稳定性较好,异丁醇产量增加了40%。成功构建pflB、frdAB、fnr和AdhE四基因缺失突变株BW25113H,结合非自身发酵途径使异丁醇的产量由3 g/L提升至4.2 g/L。     

谷氨酸棒状杆菌CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除技术的比较

【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高,难以对其进行代谢工程改造,不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1和Cre/loxP基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(CorynebacteriumglutamicumATCC13032)基因组上的argR和argF基因进行敲除,比较两种敲除方法的优缺点,为合理选择敲除系统提供依据。【方法】特异性重组的Cre/loxP敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP的kanR片段,然后由重组酶Cre识别loxP位点并发生重组反应,从而去除替换到基因组上的kanR片段,进一步利用质粒的温敏特性将其消除,从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1敲除系统是利用Cpf1对pre-crRNA进行加工,形成的成熟crRNA引导Cpf1识别和结合到靶DNA的特定序列上并切割双链DNA分子,通过同源重组作用去除靶基因,基于质粒自身的温敏特性将其消除,从而完成基因敲除的整个过程。【结果】Cre/lox P系统可在8N+2 d内完成N轮迭代基因敲除,而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2d内完成N轮迭代基因无痕敲除,理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑,效率更高,但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。【结论】与Cre/loxP系统相比,CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除,理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高,然而编辑效率还有提高的空间。     

直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析

以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）SYPS-062 glyA基因为研究对象,比较cglutamicum SYPS-062与C．glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码434个氨基酸,分子量为46．5kD,基因的同源性为99．54％,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明SYPS-062 glyA基因的差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicum SYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。     

CglI基因在大肠杆菌中的功能活性分析

通过PCR技术从谷氨酸棒杆菌基因组中扩增CglI基因,克隆到载体pMD18-T Simple后测序。将CglI基因亚克隆到表达载体pJL23,构建重组质粒pJL23-CglI,转化大肠杆菌HB101菌株,通过PCR反应筛选鉴定阳性克隆。通过噬菌体感染实验,初步分析了CglI基因在大肠杆菌中的功能活性。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1在谷氨酸棒状杆菌中的表达及优化

【背景】口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的感染牛、羊和猪等偶蹄动物的主要疫病之一。口蹄疫病毒的结构蛋白VP1包含多个能够引起机体免疫反应的主要位点,因此VP1是研究亚单位疫苗的方向靶标。谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)作为安全生产菌株,是医药用蛋白生产的优势细胞工厂。【目的】利用C. glutamicum作为受体菌株表达外源蛋白的优势实现VP1的外源表达。【方法】根据VP1结构蛋白的基因序列、相应功能和C. glutamicum的密码子偏好性设计并合成VP1基因,与pXMJ19载体连接构成重组质粒pXMJ19-VP1。C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株用于表达VP1-6×his蛋白,并对蛋白表达元件启动子、5′非翻译端(5′UTR)、目的蛋白自身N端等进行优化,同时对培养条件等进一步优化,采用SDS-PAGE和Western blotting技术检测VP1蛋白的表达情况。最后应用间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定本研究中生产的VP1的免疫活性。【结果】SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明VP1蛋白能在C. glutamicum CGMCC 1.15647菌株成功表达,将P_tac启动子替换为合成型启动子P_H36能提高蛋白产量。在此基础上,通过插入不同的5′UTR序列和VP1蛋白N端氨基酸的改变能进一步提高蛋白产量并可利用CspB信号肽实现分泌表达。发酵试验表明,VP1摇瓶发酵培养最优条件为30 ℃、24 h。ELISA试验表明,本研究中的VP1可与阳性血清特异性结合。【结论】本研究在谷氨酸棒状杆菌中成功表达FMDV的VP1蛋白,并通过优化蛋白表达元件的方法进一步提高了产量,为开发新型FMD免疫诊断试剂和安全高效的亚单位疫苗奠定了良好的基础。     

影响生物工程菌发酵产率的因素

随着分子生物学的迅速发展,生物工程已成为生物学的带头学科。由于它能定向地改变生物的遗传结构,获得优良品系,创造某些特殊的或廉价的生物、医药、化工等产品,不断地吸收着大量的科学工作者、企业、商业界的及政府的兴趣。 发酵过程是生物工程的重要环节。应用基因工程,细胞融合等手段得到理想的生物工程菌,其主要目的在于通过发酵生产、扩大产品并得到应用。     

细菌苏氨酸脱水酶受L-异亮氨酸反馈抑制的关键在于其调控结构域

苏氨酸脱水酶是细菌L-异亮氨酸合成途径中的关键酶,酶活力受终产物L-异亮氨酸的反馈抑制。苏氨酸脱水酶包含催化结构域及调控结构域,其中调控结构域所起的作用有待进一步研究。本文在大肠杆菌中分别克隆表达了四种不同的苏氨酸脱水酶:来自谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶CgIlvA及其不合调控结构域的突变体CgIlvA~M和来自大肠杆菌的苏氨酸脱水酶EcIlvA及其不合调控结构域的突变体EcIlvA~M。通过蛋白纯化和酶活分析发现,CgIlvA~M和EcIlvA~M的酶活力比CgIlvA和EcIlvA的酶活力有所降低,但它们不再受L-异亮氨酸的反馈抑制,说明L-异亮氨酸对苏氨酸脱水酶的反馈抑制是通过其调控结构域来实现的。