抑制剂促进紫杉醇生物合成的初步研究

研究了５－甲基－ＤＬ－色氨酸（５－ＭＴ）,丙二酸钠等１１种代谢抑制剂对红豆杉悬浮培养细胞生长和紫杉醇生物合成速率的影响,筛选取５－ＭＴ等３种对紫杉醇生物合成有促进作用的抑制剂,抑制剂在稳定期添加剂红豆杉细胞生长无强烈的抑制作用。更有利于紫杉醇的生物合成,各抑制剂与前体和真菌诱导协同作用提高增产效果,增产大小依次为５－ＭＴ,马来酸和丙二酸钠,其中５０ｍｇ·Ｌ＾－１５－ＭＴ使紫杉醇含量提高近１０倍,１     

前体化合物与诱导子对紫杉醇和紫杉烷类化合物合成的调控作用

添加Ｄ,Ｌ－β－苯丙氨酸和苯丙氨酸没有显著促进紫杉醇的合成,乙酸和苯甲酸对紫杉醇的合成有抑制作用,Ｃ１３位侧链合成的前体含量并不是合成紫杉醇的限制性因素。１￣３ｍｇ／Ｌ的α－亚麻酸没有促进紫杉醇和紫杉烷类化合物的合成。茉莉酮酸显著地促进了紫杉醇的合成,５ｍｇ／Ｌ茉莉酮酸处理的紫杉醇含量达到１３４μｇ／ｇＤＷ,是对照的９倍。     

红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇的研究

研究了两相培养系统中红豆杉细胞的生长与代谢规律,经４０天培养,细胞生物量为１７．８５ｇ／Ｌ（干重）,紫杉醇产量为３０．１９ｍｇ／Ｌ。     

水杨酸对红豆杉细胞的诱导作用

通过添加不同浓度的水杨酸（ＳＡ）,比较了它们对红豆杉细胞过氧化物酶（ＰＯＤ）、苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）含量及以细胞生长和紫杉醇含量的影响,结果表明,ＳＡ可提高ＰＯＤ及ＰＡＬ的活性,促进细胞内Ｈ２Ｏ２含量的上升并有利于紫杉醇的合成,其中２０ｍｇ／Ｌ ＳＡ对紫杉醇合成的促进效果最明显,紫极醇含量可达对照组的１３倍。     

芹菜体细胞胚胎发生及干化体细胞胚的研究

以芹菜无菌苗为材料,在ＭＳ附加ＫＴ ０．５ｍｇ／Ｌ,ＡＢＡ０．２５ｍｇ／Ｌ,脯氨酸５００ｍｇ／Ｌ,ＣＨ５００ｍｇ／Ｌ的培养基上,采用静止与震荡交替进行的培养方式,可获得大量健壮的子叶期胚状体（体胚）。干燥可以提高贮茂后体胚的转换率,特别是在低温,高湿中缓慢干燥,并在干燥前用ＡＢＡ预处理效果更好。通过干燥和不干燥体胚扫描电镜观察和电导值及脱氢酶的比较,发现干燥体胚有助于贮藏期间细胞结构及膜系统的保持     

红豆杉细胞悬浮培养中不同添加物对细胞生长和紫杉醇合成的影响

采用正交实验检测红豆杉（Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐｉｌｇｅｒ）Ｒｅｈｄ．）细胞悬浮培养中水杨酸、Ｄ－果糖、甘露醇和硫酸镧对细胞生长和紫杉醇（ｔａｘｏｌ）积累的影响。添加１０ｇ／ＬＤ－果糖,可使细胞的鲜重和干重明显增加;添加６０ｇ／Ｌ甘露醇使细胞的鲜重和干重明显减少;１ｍｇ／Ｌ水杨酸仅使细胞鲜重增加,对干重影响不明显;硫酸镧对细胞生长无明显影响。单独添加这４种物质,紫杉醇含量均下降,同时添加     

影响木薯次生胚状体发生及植株再生因素的研究

研究了在外植体的不同发育阶段中,碳源以及不同的生长激素配比对木薯次生胚状体诱导及植株再生的影响。结果表明：以固体成熟培养基上生长１５ｄ的胚状体子叶为外植体,次生胚状体的产量最高,达２９．３个成熟胚状体／１个外植体。在次生胚状体的诱导阶段,以麦芽糖（４０ｇ／Ｌ）代替蔗糖作碳源,能同时提高次生胚状体的产量（３２．５个胚次体／１个外植体）及植株再生频率（７４．３％）。２,４－Ｄ与ＰＰ３３３;（０．１ｍｇ／Ｌ）配合能提高植株再生频率到７７．６％。２,４－Ｄ与ＢＡＰ（２ｍｇ／Ｌ）或激动素（２．０ｍｇ／Ｌ）配合则大大降低了胚状体诱导及植株再生频率。     

黄花蒿培养细胞中青蒿素合成代谢的体外调节

黄花蒿培养细胞通过两步培养积累青蒿素．第１步在含有０．２～０．４ｍｇ／Ｌ６－苄基氨基嘌呤（６－ＢＡ）和３～４ｍｇ／Ｌ吲哚乙酸（ＩＡＡ）的Ｎ６培养基中进行细胞的增殖培养,第２步将培养好的细胞转入含０．２～０．４ｍｇ／Ｌ６－ＢＡ和０．２～０．４ｍｇ／ＬＩＡＡ的改良Ｎ６培养基中进行青蒿素的合成．青蒿素的合成量为１９０μｇ／ｇ干细胞左右．当在第２步培养中加入青蒿素合成前体青蒿酸,青蒿素合成量比仅靠激素诱导提高了３倍多．青蒿素的合成途径是植物固醇合成途径的分支途径,当在青蒿素合成过程即第２步培养中加入固醇生物合成抑制剂双氯苯咪唑和氯化氯胆碱处理,可使代谢向合成青蒿素的方向移动,青蒿素合成量明显提高．经２００ｍｇ／Ｌ氯化氯胆碱处理２ｄ,黄花蒿细胞合成青蒿素量为３７２μｇ／ｇ干细胞;经２０ｍｇ／Ｌ双氯苯咪唑处理４ｄ,黄花蒿细胞合成青蒿素量为１５４０μｇ／ｇ干细胞,比靠激素诱导提高了８倍多,与诱导脱分化细胞的黄花蒿叶中所含的青蒿素（３０００μｇ／ｇ干细胞）处于同一个数量级．以上结果表明：在通过植物激素调节可以合成青蒿素的黄花蒿培养细胞中,缺乏青蒿素合成前体是青蒿素合成量低的重要原因．因此,在青蒿素合成的过程中通过体外调节,     

生长调节物质对紫杉醇和紫杉烷类化合物合成的调控作用

植物生长调节物质不但控制细胞分裂,也影响着紫杉醇或紫杉烷类化合物的合成,５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ ＢＡ有利于紫杉愈伤组织的生长。随着ＢＡ深度伯提高,愈伤组织的增长率明显下降但是,其紫杉醇含量却有所增加。ＢＡ与ＮＡＡ的比例在有利于１０－去乙酰浆果赤霉素Ⅲ合成,添加高浓度ＧＡ５和ＣＣＣ均掏紫杉愈伤组织的生长,２ｍｇ／ＬＧＡ３、１ｍｇ／Ｌ ＣＣＣ有利于紫杉醇的合成。     

胡杨离体器官发生及试管无性系的建立

研究了离体条件下胡杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ　Ｏｌｉｖｅｒ）茎段、叶片及愈伤组织的器官发生和植株再生技术。离体培养以ＭＳ为基本培养基并附加４０ｍｇ／Ｌ腺嘌呤和５００ｍｇ／Ｌ水解乳蛋白。离体叶片和茎段在ＢＡ为０．５ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ为０．５ｍｇ／Ｌ的培养基上诱导产生愈伤组织,并在含０．２５ｍｇ／ＬＢＡ和０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ的培养基上继代增殖。ＢＡ为０．５ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ为０．１ｍｇ／Ｌ可诱导叶片和愈伤组织发生不定芽,诱导频率分别为１００％和８２．９％,对于茎段,ＢＡ和ＮＡＡ分别为０．１ｍｇ／Ｌ和０．０１ｍｇ／Ｌ时诱导不定芽频率可达８３％。试管苗在大量元素减半并附加０．０１５ｍｇ／ＬＮＡＡ的ＭＳ培养基上诱导生根,生根率达８６．２％。     

东北红豆杉细胞培养生产紫杉醇的调控研究

研究了诱导子、前体及抑制剂的协调作用对东北红平杉生产紫杉醇的影响。结果表明,向培养基中加入80mg/L水到、80mg/L茉莉酸甲酯、0.5mmol/L乙酸钠、2mmol/L苯丙氨酸、0.5mmol/L丝氨酸、0.1mmol/L甘氨酸、10mg/L肉桂酸、0.5mmol/L苯甲酸钠、5mmol/L丙酮酸钠、10mg/L氯化氯胆碱、和1mg/L赤霉酸可使紫杉醇含量提高368.65%。并且证明交互作用对紫杉醇合成有显著作用。     

前体对水母雪莲悬浮培养细胞黄酮合成的影响

在水母雪莲（Saussurea medusa Maxim)细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠3种前体。结果显示,3种前体均能促进细胞内黄酮的生物合成,但它们对细胞的生长也有一定的抑制作用。实验表明,3种前体的添加时间均以第6天为宜。苯丙氨酸的最佳添加浓度为0.05mmol/L,肉桂酸、乙酸钠的最佳添加浓度都是0.1mmol/L。3种前体中,难溶于水的肉桂酸对黄酮合成的促进作用最强,它可使培养物的黄酮产量高达1801mg/L,是对照1．98倍。苯丙氨酸、乙酸钠两种前体协同添加,比它们单独加入更能促进细胞的黄酮合成。     

Salicylic acid-induced taxol production and isopentenyl pyrophosphate biosynthesis in suspension cultures of Taxus chinensis var. mairei

The influences of salicylic acid (SA) on taxol production and isopentenyl pyrophosphate (IPP) biosynthesis pathways in suspension cultures of Taxus chinensis var. mairei were investigated by adding SA and mevastatin (MVS), a highly specific inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in the mevalonate pathway for IPP biosynthesis, into the culture systems. The cell death and taxol production were induced upon the introduction of SA, and 20mg/l was proved to be the optimal SA concentration in terms of the less damage to Taxus cells and marked activation of phenylalanine ammonia lyase (PAL). In the coexistence of SA (20mg/l) and MVS (100 nmol/l), the taxol content (1.626 mg/g dry wt) was higher than that (0.252 mg/g dry wt) of the MVS-treated system but almost equal to that (1.581 mg/g dry wt) of the SA-treated system. It is thus inferred that the activated non-mevalonate pathway should be responsible for the formation of IPP in taxol biosynthesis in the presence of SA.     

红豆杉细胞培养产物提取策略及其对紫杉醇的影响

研究了硫酸铈铵及原位提取对红豆杉细胞悬浮培养过程中细胞生长、紫杉醇合成及释放的影响。红豆杉细胞悬浮培养过程中培养第12d添加2mg/L硫酸铈铵能获得最大紫杉醇产量8．3mg/L,其中2．4mg/L释放到细胞外,分别为对照组的4倍及12倍。同时添加2mg/L硫酸铈铵、5％油酸(v/v)时胞外紫杉醇产量达到9mg/L,为对照组的45倍。将硫酸铈铵及原位提取与补料培养相结合,最高紫杉醇产量可达24．5mg/L,其中60％释放到胞外。     

溶氧水平对红豆杉细胞悬浮培养的影响研究

紫杉醇 (Ｔａｘｏｌ)是源自红豆杉提取物的一种高度衍生化的二萜类化合物 ,临床实验结果表明紫杉醇对于卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌等具有明显的抗肿瘤活性[1] ,因而受到世界各国的广泛关注 ,并已被美国食品与药品管理局 (ＦＤＡ)批准用于卵巢癌与乳腺癌的治疗[2 ] 。到目前为止紫杉醇仍然主要从树皮中提取 ,但由于红豆杉生长缓慢 ,天然资源非常有限 ,加快其替代来源的研究势在必行。利用植物细胞悬浮培养生产紫杉醇作为一种可行的选择 ,近年来取得了较大的进展[3 ,4 ] 。本文研究了摇瓶及 2 0 Ｌ反应器培养过程的溶氧水平对细胞生长及紫杉醇…     

水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导作用的研究

研究了水杨酸对红豆杉细胞培养中紫杉烷合成的影响。在适宜浓度的水杨酸诱导下,紫杉醇(Taxol)的产量提高了近3倍,同时10去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)与巴卡亭Ⅲ(Baccatin Ⅲ)相应上升。通过对紫杉醇合成代谢途径的动力学分析,初步推断水杨酸的加入提高了10-DAB合成速率。并通过水杨酸和硝酸银的配伍诱导,实现了诱导子之间的协同作用,获得了39 mg/L的紫杉醇含量,比两个诱导子单独作用时的最高含量之和还高出50%。     

Effect of the culture medium and biotic stimulation on taxane production in Taxus globosa Schltdl in vitro cultures

Taxus globosa is the only species of the Taxus genus that grows in Mexico. In this study, callus cultures from leaves and young shoots of T. globosa were established in Gamborg’s B5 medium supplemented with 2,4-dichlorophenoxiacetic acid (2 mg/L), kinetin (0.5 mg/L) and gibberellic acid (0.25 mg/L). Callus growth and taxane production were evaluated using two culture media: Woody Plant Medium and Gamborg’s B5 supplemented with picloram (2 mg/L), kinetin (0.1 mg/L) and gibberellic acid (0.5 mg/L). The effect of the inoculum size (50, 100 and 150 g FW/L) and culture media (Woody Plant Medium and Gamborg’s B5) with and without the presence of methyl jasmonate (100 μM) on T. globosa cell suspensions was assessed. Taxane analysis revealed that the calli in Gamborg’s B5 produced taxol (50 μg/g DW), baccatin III, 10-deacetyl baccatin III and 10-deacetyl taxol. Woody Plant Medium also induced the production of taxol, although to a lesser extent. The optimum inoculum size was 50 g FW/L. In cell suspension cultures, both media had a significant effect on taxane production when supplemented with methyl jasmonate. In Woody Plant Medium, at day 14, a total concentration of 197.999 μg/L of taxol, 160.622 μg/L of baccatin III, 633.724 μg/L of 10-deacetyl baccatin III and 229.611 μg/L 10-deacetyl taxol were obtained, with total excretion of baccatin III and 10-deacetyl taxol to the culture medium. In Gamborg’s B5, cephalomanine was obtained at a concentration of 91.428 μg/L without elicitation, and all taxanes were excreted to the medium to a variable extent.     

磷甘霉素和洛伐它汀处理对中国红豆杉悬浮培养细胞生物合成紫杉醇的影响

采用非甲羟戊酸途径抑制剂磷甘霉素和甲羟戊酸途径抑制剂洛伐它汀对中国红豆杉悬浮细胞培养物进行处理.在添加和未添加茉莉酸甲酯诱导的情况下,前者使紫杉醇产量减少了2/5和1/5,后者使紫杉醇产量减少了1/6和1/10,表明两种途径对紫杉醇的生物合成都具有贡献,其中非甲羟戊酸途径贡献较大;通过定量PCR技术分别检测两条途径的关键酶5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)mRNA水平的变化,发现两种抑制剂都能够激活hmgr和dxr的转录,表明两种代谢途径之间存在协同作用,共同为紫杉醇的生物合成提供前体.     

一株产紫杉醇内生真菌YN6的分离及鉴定

从云南红豆杉（Taxus yunnanensis）树皮内表皮中分离得到75株内生真菌,采用基于紫杉醇合成关键酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰基转移酶（10-deacetylbaccatin Ⅲ-10-O-acetyl transferase,DBAT）和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶（C-13-phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase,BAPT）基因为标志分子的快速筛选方法获得一株可产紫杉醇的内生真菌YN6,并通过高效液相色谱法和质谱法对其紫杉醇进行分析.同时,通过对内生真菌YN6的形态特征分析以及18S rDNA序列分析将其初步鉴定为拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）真菌. 拟盘多毛孢YN6的紫杉醇产量约为120~140 μg/L,是目前已报道的紫杉醇产量较高的野生菌株之一. 拟盘多毛孢YN6的发现为微生物发酵生产紫杉醇提供了潜在的优良种质资源.