流感裂解疫苗H3N2-抗H3N2免疫原性复合物滴鼻诱导小鼠黏膜免疫应答的研究

目的研究流感裂解病毒疫苗抗原抗体复合物滴鼻诱生小鼠黏膜免疫应答.方法分别以15μg H3N2、H3N2-CpG、H3N2-鼠抗H3N2及H3N2-PEG滴鼻免疫小鼠,检测肺泡灌洗液抗H3N2 IgA、血清抗H3N2 IgG效价.取免疫小鼠脾细胞,体外抗原刺激,用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液IFN-γ及IL-4分泌水平.结果H3N2-抗H3N2免疫原性复合物诱生的抗H3N2 IgA效价明显高于H3N2单独免疫组(P＜0.01),而与H3N2-CpG组无显著性差异.此外,复合物诱生的血清抗H3N2也高于H3N2单独免疫组(P＜0.05).H3N2-CpG组诱生的IFN-γ水平明显升高,而其他组之间无明显差异.结论流感病毒血凝素抗原抗体复合物、血凝素抗原加CpG佐剂可以诱生较强的局部黏膜免疫和体液免疫.这两组诱生的IgA效价均明显高于H3N2单独免疫组.另外,H3N2-CpG组小鼠的脾脏细胞经特异性抗原诱导后培养上清液中的IFN-γ水平明显升高.     

流感病毒NP表位序列增强H7N9 HA DNA疫苗免疫效果研究

为增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,本文构建了含有流感病毒NP的5个重复优势T表位或B表位(包括B_1线性表位和B_2构象表位)的表达质粒(简称NPT和NPB),以小鼠为动物模型,将NPT和NPB分别与H7N9流感病毒HA DNA混合免疫BALB/c小鼠1次,21 d后用致死剂量(20 LD_(50))的H7N9流感病毒攻击小鼠。通过检测免疫后小鼠血清特异性抗体滴度和攻毒后的免疫保护性指标-存活率、肺部残余病毒滴度及体重丢失率,评价表位质粒与HA DNA疫苗混合免疫对小鼠的保护效果。试验结果表明:用致死性H7N9流感病毒攻击小鼠后,HA DNA组小鼠全部死亡,HA+NPT免疫组小鼠存活率达到100%,HA+NPB1和HA+NPB2免疫组,小鼠存活率分别为30%和75%;混合免疫HA+NPT后小鼠抗体滴度升高明显,攻毒后小鼠体重丢失明显降低。综上表明,含有5个NP优势T表位或B表位的表达质粒能增强H7N9流感病毒HA DNA疫苗的免疫效果,混合免疫一次可以使小鼠得到较好的保护。HA DNA和表位疫苗的混合免疫,节约了疫苗用量,降低了免疫成本,为流感病毒核酸疫苗的临床开发提供了一定的试验基础。     

人参多糖对新甲型H1N1流感病毒灭活疫苗的免疫增强作用

在流感灭活疫苗中添加佐剂可以提高疫苗的免疫原性,节约抗原用量。一些天然中草药多糖具有潜在的佐剂效应。本文探讨了人参多糖（ginseng polysaccharide,GPS）在新甲型H1N1流感病毒裂解型灭活疫苗中的佐剂效应。将不同剂量GPS与新甲型H1N1流感病毒灭活疫苗混合,共同免疫小鼠一次,通过检测免疫后在小鼠体内诱导产生的疫苗特异性IgM、IgG、IgG1和IgG2a抗体情况来评价GPS作为流感病毒灭活疫苗佐剂的免疫增强效果,并与不添加佐剂的疫苗和加有铝佐剂的疫苗的免疫效果作比较。结果显示,GPS与铝佐剂一样能显著提高和维持疫苗特异性IgG抗体滴度,同时提高IgM抗体水平,其中800μgGPS的佐剂效果最好。因此我们认为GPS可以作为流感病毒灭活疫苗的一种候选佐剂。     

H7N9流感病毒感染神经系统相关细胞特征分析

H7N9流感病毒感染人类不仅可以侵犯呼吸系统,偶尔还会侵犯中枢神经系统引发流感病毒性脑病(Influenza-associated encephalopathy,IAE)。IAE是引起H7N9感染者死亡的重要因素,但其致病机制尚未阐明。为研究H7N9流感病毒引发IAE的致病机制,本研究以小鼠小胶质细胞(Bv2)以及小鼠神经瘤母细胞(N2a)为研究对象,细胞免疫荧光激光共聚焦显微镜观察Bv2、N2a细胞上流感病毒相关受体SA-α2,6-Gal、SA-α2,3-Gal分布;微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测H7N9感染Bv2、N2a细胞扩增情况;液相芯片法检测H7N9感染Bv2、N2a细胞后细胞因子分泌情况。结果显示,Bv2、N2a细胞上都有流感病毒感染相关受体SA-α2,6-Gal、SA-α2,3-Gal的分布。H7N9流感病毒可以成功感染Bv2、N2a细胞,且病毒在Bv2细胞内的扩增效率明显高于N2a细胞。H7N9感染Bv2细胞后出现部分细胞因子分泌量升高现象,而感染N2a细胞后未出现。本研究成功建立了H7N9流感病毒感染Bv2以及N2a细胞模型,...     

新型H7N9病毒在同居小鼠中的传播途径

目的进一步了解新型H7N9流感病毒的致病性、传播能力以及通过何种途径进行传播。方法 H7N9病毒感染小鼠后与同居小鼠合笼,研究同居小鼠的临床变化指征、病毒复制情况、病毒在组织中的分布以及病理变化。以同居小鼠分泌物接种其他小鼠,观察同居小鼠通过何种途径传播病毒。结果 H7N9病毒可以在肺组织、肠组织和脑组织中复制,并可以在同居小鼠中传播。H7N9病毒感染小鼠其咽、眼分泌物以及粪便均具有感染性,其中尤以咽拭子的传播风险最高。结论 H7N9病毒可以不通过适应就感染小鼠,并引起小鼠间传播。被感染小鼠分泌物具有感染性。     

A/H7N9流感病毒神经氨酸酶进化分析

世界卫生组织报道2013年在中国出现首例人感染H7N9流感病毒病例,这在我国一定的范围内造成了危害,引起了恐慌,因此利用生物信息技术对其进行研究显得十分必要。神经氨酸酶NA是流感病毒最重要的抗原之一,也是抗流感药物的重要作用靶点。从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库下载A/H7N9流感病毒NA基因核酸序列及其编码蛋白序列,利用MEGA5.0软件对核苷酸编码序列构建系统进化树,利用BioEdit软件进行比对,分别作核苷酸与氨基酸同源性计算,继而分析NA基因重要位点变异情况,结果显示H7N9流感病毒传播呈现一定的地域关系和时间关系,2013年流行的中国的毒株属于亚欧型,其NA茎区发生了比较明显的变异,这也许是该病毒感染人类的原因之一。这些分析结果对于研究H7N9流感病毒基因的进化关系和变异趋向具有重要的参考价值。     

糖尿病小鼠对H5N1病毒的易感性及灭活疫苗诱导的免疫反应

糖尿病患者免疫功能低下,是流感病毒感染的高危人群.研制有效的流感病毒疫苗对糖尿病患者尤为重要.以注射STZ的方法建立糖尿病小鼠模型,比较糖尿病小鼠和健康小鼠对H5N1病毒易感性的差异.病毒感染3 d后糖尿病小鼠的肺部病毒滴度比健康小鼠高,显示糖尿病小鼠对H5N1病毒更易感.用一次免疫的方法接种不同剂量的H5N1灭活疫苗(单独免疫或与佐剂共同免疫),比较其在糖尿病小鼠和健康小鼠诱导抗体应答的能力.一次免疫H5N1流感病毒灭活疫苗可诱导糖尿病小鼠产生体液免疫应答,但其抗体量低于健康小鼠,增加疫苗剂量可提高抗体水平.佐剂能增强H5N1全病毒灭活疫苗在糖尿病小鼠体内诱导的抗体反应.     

流感疫苗呼吸道黏膜免疫效应的研究进展

流感病毒通过感染呼吸道黏膜上皮细胞而入侵机体,呼吸道黏膜是机体最先接触大量病毒、细菌等吸入抗原的部位。呼吸道黏膜既可以在黏膜局部又可以引起全身对病原体感染的保护性免疫应答。近年来,随着呼吸道黏膜免疫疫苗的发展,诱导呼吸道黏膜的防御机制得到进一步深入研究。黏膜免疫分子、细胞在其中的作用逐步明确,又为黏膜免疫疫苗的发展奠定了基础。本文将从呼吸道黏膜免疫角度论述流感病毒呼吸道免疫防御机制及其滴鼻疫苗的应用。     

流感病毒H7N9病毒样颗粒疫苗的研发

<正>最近,中国出现了由禽源性流感病毒A(H7N9)引起的严重性传染病,为此全球付出努力,来实现候选疫苗的快速研发。目前,非流感病毒A(H7N9)H7亚型流感候选疫苗在面对新近出现的流感病毒A(H7N9)时,其免疫原性低,保护效果差。一种流感病毒A(H7N9)重组候选疫苗,是将A/Anhui/1/2013株的血凝素(HA)、神经氨酸苷酶(NA)和A/Indonesia/05/2005(H5N1)株的基质蛋白1(M1)克     

H7N9流感病毒感染A549细胞蛋白质组学的初步研究

通过建立H7N9和H1N1流感病毒(H1N1pdm09)感染人肺癌上皮细胞(A549)模型,研究病毒感染细胞后细胞蛋白质组学差异变化,探讨H7N9流感病毒感染人类致病机制。将感染复数(MOI)为0.001的H7N9、H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h后提取细胞总蛋白进行荧光双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)和基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析鉴定差异蛋白。质谱共鉴定出H7N9和H1N1pdm09流感病毒感染A549细胞24h、48h、72h上调或下调的差异蛋白分别为11、12、33个。对差异蛋白进行功能分析发现与H1N1pdm09感染组相比,(纤)丝状肌动蛋白成帽蛋白α1(F-actin-capping protein subunit alpha-1,CapZ-α1)、鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase,OAT)、Poly(rC)-binding protein 1(PCBP1)、真核翻译起始因子5A-1(Eukaryotic translation initiation factor 5A-1,eIF5A)在H7N9感染A549细胞后表达量的下调加速了致细胞病变效应。血小板活化因子乙酰水解酶Ⅰb亚基β(Platelet-activating factor acetylhydrolaseIb subunit beta,PAFAH1B2)在H7N9感染A549细胞后期表达量显著降低可能与该病毒感染患者的临床症状相关。     

季节性流感疫苗对小鼠感染H7N9禽流感病毒的保护效力

目的评价季节性流感裂解疫苗对流感病毒H7N9的免疫保护效力。方法用我国2012~2013年度季节性流感裂解疫苗,以腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠,并设PBS免疫模型组,末次免疫14 d后以5 LD50A/Anhui/1(H7N9)进行攻试验。感染后观察记录小鼠临床表现,体重变化,并分别于第2天和第4天每组处死3只小鼠,取肺组织和鼻甲骨测病毒滴度和载量。结果感染后疫苗与模型组小鼠体重下降明显,疫苗组存活率为10%,模型组全部死亡。感染后第4天疫苗组鼻甲骨滴度显著低于模型组。血凝抑制试验及中和实验表明免疫小鼠血清无中和H7N9病毒抗体。结论季节性流感疫苗在小鼠中对于H7N9流感病毒感染无明显保护作用。     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

人H7N9禽流感病毒、高致病H5N1禽流感病毒及H1N1流感病毒感染小鼠特征分析

目的对比分析人高致病H5N1禽流感病毒、H7N9禽流感病毒及H1N1流感病毒分别感染BALB/c小鼠后的机体反应特征。方法分别以H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠存活率、体征变化及感染后肺组织病理损伤差异,检测小鼠感染流感病毒后肺组织增殖细胞核抗原(PCNA)表达并观察小鼠感染后修复状况。结果 H7N9病毒、H5N1病毒和H1N1病毒均感染BALB/c小鼠,小鼠存活率依次为H7N9H1N1H5N1,肺组织病理损伤严重程度依次为H5N1H1N1H7N9,PCNA表达水平依次为H7N9H1N1H5N1。结论 H7N9病毒感染后宿主炎症反应较小,感染后小鼠肺组织自我修复能力较强;H5N1病毒感染BALB/c小鼠后的机体反应最为强烈,感染后恢复能力差,致死率高。     

2009年甲型H1N1流感病毒抗体可广泛免疫多种流感病毒

2009年H1N1流感大流行疫情证明了变异的流感病毒株已经对全人类的健康造成了威胁。根据2011年1月一篇文献报道,研究人员发现感染过甲型H1N1流感病毒的人体内会产生抵御其他多种流感病毒的     

阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响

目的研究阳离子脂质体DOTAP佐剂对H5N1型流感病毒裂解疫苗免疫效果的影响。方法制备DOTAP阳离子脂质体流感病毒裂解疫苗(简称DOTAP流感裂解疫苗),检测其包封率。将BALB/c小鼠分为13组,分别用含0.1、1.0、10.0μg HA/只剂量以DOTAP、Al(OH)3、CPG-ODN为佐剂以及不含佐剂的流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,PBS作为对照组,用血凝抑制试验检测小鼠初次免疫后21、42天血清HI抗体滴度;用ELISA检测初次免疫后21、42天血清特异性IgG抗体、IgG1、IgG2a亚类抗体滴度,以及初次免疫后42天小鼠脾脏单个核细胞体外经抗原刺激后细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的分泌水平。将BALB/c小鼠分为3组,分别用含不同DOTAP剂量(100、300、600μg/只)的DOTAP流感裂解疫苗于0、21天皮下免疫,检测初次免疫后21、42天小鼠血清HI抗体滴度和IgG抗体滴度。结果 DOTAP流感裂解疫苗粒径在300~400 nm,带正电荷,包封率在50%以上;DOTAP流感裂解疫苗诱导的HI抗体水平和特异性IgG抗体水平均高于流感裂解疫苗,而与铝佐剂和Cp G-ODN佐剂间差异无统计学意义;DOTAP流感裂解疫苗产生的抗体仍以IgG1亚类抗体为主,免疫后42天诱导的IgG2a亚类抗体水平高于流感裂解疫苗和铝佐剂,低于Cp G-ODN佐剂;DOTAP流感裂解疫苗免疫后既分泌高水平Th1型细胞因子IFN-γ,同时也分泌高水平Th2型细胞因子IL-4;不同DOTAP剂量的DOTAP流感裂解疫苗免疫后,其HI抗体滴度和IgG抗体滴度在低、中、高剂量组之间存在明显的量效关系。结论 DOTAP作为H5N1型流感病毒裂解疫苗的佐剂可显著提高流感裂解疫苗的免疫原性,其对体液免疫应答的增强作用不低于铝佐剂和Cp G-ODN佐剂,并具有诱导细胞免疫应答的能力。     

H7N9灭活疫苗联合MF59佐剂在小鼠体内诱导的长效体液免疫应答

以BALB/c小鼠为模型,探讨H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠后所诱导的长效体液免疫应答的动态变化。不同剂量的流感H7N9全病毒灭活疫苗单独或辅以MF59佐剂肌肉注射免疫小鼠一次。连续采集免疫后小鼠15个月的血清,用ELISA方法检测特异性IgG抗体水平,血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验和微量中和(microneutralization,MN)试验检测第15个月时的HI抗体和中和抗体效价。实验结果发现,小鼠血清中的特异性IgG抗体水平随时间变化持续缓慢上升,第5个月时达到顶峰,随后略有下降但一直持续平稳状态;IgG抗体滴度与疫苗剂量成正相关,且添加佐剂能提高抗体滴度。HI及MN抗体检测表明,免疫后第15个月产生的抗体能有效中和病毒,且抗体跟疫苗剂量成正比。以上研究表明,H7N9流感病毒灭活疫苗免疫小鼠一次诱导产生的特异性抗体能在较长期内保持比较平稳的抗体滴度,为小鼠提供免疫保护;增加抗原剂量和添加MF59佐剂能增加疫苗特异性抗体水平。该研究为H7N9流感疫苗产生的长期保护效应提供了一定的数据积累和参考。     

H1N1感染背景对H9N2感染家猪的免疫保护作用

为了探索H1N1病毒感染史对H9N2病毒感染家猪的影响,本研究采用H9N2病毒分别感染有/无H1N1病毒感染史的家猪,比较两组家猪鼻腔泄毒滴度及血清转阳情况。研究发现:与无感染背景的家猪相比,H1N1病毒预感染过的家猪在接种了H9N2病毒后未检测到呼吸道泄毒。尽管两组家猪都产生了H9N2抗体,但有H1N1感染史的家猪体内的H1N1抗体水平在H9N2接种后快速显著上升,这些H1N1抗体与H9N2病毒并无血清学交叉反应。本研究提示,在自然界中,H1N1病毒在猪群中的流行极有可能为H9N2病毒在猪中的感染及传播构筑了天然的屏障,从而延缓了H9N2禽流感病毒通过家猪这一宿主获得哺乳动物适应性的进程。     

枸杞多糖对H5N1流感全病毒灭活疫苗的体液免疫增强作用

探讨枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide,LBP)作为佐剂对H5亚型流感病毒全病毒灭活疫苗的体液免疫增强效果。将流感病毒A/Vietnam/1194/2004(H5N1)灭活疫苗与不同剂量的枸杞多糖混合后以腹腔注射的方式共同免疫小鼠,免疫后三周收集血清用于特异性抗体检测。实验中设立氢氧化铝佐剂组作对照共同评价LBP作为佐剂的免疫增强效果。结果显示,小鼠血清中针对H5灭活疫苗的特异性抗体水平在一定范围内随着LBP剂量的增加而提高。LBP在800μg剂量时血清特异性抗体水平较无佐剂组显著增强,并与氢氧化铝佐剂组大致相当。因而,LBP有可能成为一种有效的流感灭活疫苗免疫佐剂。     

实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究

选取H5、H9、H7亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,利用PrimerExpress2.0软件设计了各自亚型的特异性引物和Taqman MGB探针,利用实时荧光RT-PCR一步法建立了H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的鉴别检测方法,该方法特异性好,重复性佳,对其他疫苗无交叉反应。结果表明实时荧光PCR方法为禽流感灭活疫苗提供了一种特异、敏感、快速和简洁的鉴别检测方法。