鉴别检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR的建立

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)引起的猪的一种急性、高度接触性传染病.本研究根据ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因设计了 3套引物和探针,建立了可同时鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重荧光PCR方法.结果表明,该法特异性强,可同时检测ASFV B646L、MGF360-14L和CD2v基因,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪A型塞内卡病毒等无交叉反应;两份ASFV MGF360-505R与CD2v基因联合缺失疫苗株DNA三重荧光PCR法检测结果都仅出现一条B646L扩增曲线,与预期一致;灵敏度高,该法对重组质粒pUC-B646L、pUC-360-14L和pUC-CD2v的检出限分别为1.572×103拷贝/mL、1.934×103拷贝/mL 和 1.929×103拷贝/mL,灵敏度比世界动物卫生组织(World organization for animal health,OIE)推荐的荧光PCR高10倍;重复性好,对三种重组质粒检测的Ct值批内和批间变异系数均小于2％;应用该法及OIE推荐的荧光PCR对1 215份样品进行平行检测,结果显示23份样品为阳性,1 192份样品为阴性,两种方法检测结果一致.本研究建立的方法能鉴别检测ASFV野毒株和基因缺失疫苗株(缺失MGF360-505R和/或CD2v基因),对将来基因缺失疫苗的推广应用及ASF疫情防控具有重要的意义.     

基于SecA基因的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法的建立及进化分析

为对诺卡氏菌病进行快速早期诊断,建立了鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)TaqMan qPCR检测方法。以鰤鱼诺卡氏菌的管家基因SecA为靶标设计引物和探针,对反应条件进行优化,制作标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性测试,并将建立的方法应用于临床样品的检测。结果表明,优化后,引物和探针终浓度分别为0.3和0.1μmol/L,退火延伸温度60℃时,qPCR在9.85×10¹⁰—9.85×10⁰ copies内呈良好的线性关系,灵敏度最高达9.85 copies;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于1%;特异性结果表明,对无乳链球菌、弗氏柠檬酸杆菌和维氏气单胞菌等13种病菌均无扩增曲线;临床对42份大口黑鲈样品进行检测,结果表明,qPCR检出率比普通PCR提高14.24%;对发病大口黑鲈的组织及结节部位检测显示,结节部位菌载量大幅高于非结节部位,最高相差1000倍;SecA基因分析结果显示,SecA基因在传代中和种内高度保守,种间具有一定的离散性,是个很好的用于诺卡氏菌种鉴定的靶基因。研究建立的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方...     

全细胞多重PCR检测蓝藻、微囊藻及产毒微囊藻方法初探

选取三对分别针对微囊藻、蓝藻16S rDNA及微囊藻毒素合成酶基因mcyB的保守序列的特异性引物209F/409R、27F1/409R、MTR/MTF,其中409R为一条共用引物。设计并优化了一种可以同时检测蓝藻和微囊藻的两重全细胞PCR方法和一种可以同时检测蓝藻、微囊藻和可产毒微囊藻的三重全细胞PCR方法,并且测试了这两种PCR反应的灵敏度区间,分别为10⁵～10³cell·mL^-1、10⁵～10²cell·mL^-1。对采集水库水样检测结果表明双重全细胞PCR方法可以直接应用于对天然水样的检测,三重全细胞PCR方法可用于实验室培养藻细胞的筛查。全细胞多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,在水体微囊藻毒素检测预警方面具有应用价值。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

油气田土壤甲烷氧化菌实时荧光定量PCR检测技术的 建立与应用

【目的】建立快速检测甲烷氧化菌含量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术,用于油气微生物勘探。【方法】以含有甲烷氧化菌功能基因pmoA片段的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立标准曲线,进行敏感性、重复性和特异性评价,并将该技术用于实际样品的检测。【结果】该技术标准曲线的相关系数R2为0.999 9,扩增效率为99.976%,检测范围为3.897×101-3.897×109 copies/μL,检出限约为40 copies/μL,重复性实验中CT值的变异系数优于3%,对12种非甲烷氧化菌均没有扩增,显示该技术具有很好的敏感性、重复性和特异性。利用该技术对气田、油田和非油气田土样进行了检测,发现气田具有明显的异常高值。【结论】为油气田的勘探建立了一种高效、特异、灵敏、准确的甲烷氧化菌荧光定量PCR检测技术,同时为其它指示菌检测技术的建立提供了参考。     

PRRSV NADC30-like SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立与应用

为建立高效快速的PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据NADC30毒株Nsp2基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性实验以及临床样品的检测。结果显示,标准品在10~7 copies/μL到10~2 copies/μL浓度范围内具有良好的线性关系,最低检测浓度为2.25×10~1 copies/μL;该方法与HP-PRRSV、PCV、PEDV、TGEV、PRV、CSFV、PoRV无交叉反应,批内和批间的变异系数(CV)小于1.9%,在临床样品的检测中较普通PCR有更高的检出率。建立了PRRSV NADC30-Like毒株荧光定量PCR检测方法,具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于PRRSV NADC30-Like感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。     

3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg²⁺浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×¹⁰3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×¹⁰3拷贝/mL~1.0×¹⁰10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×¹⁰4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×¹⁰4拷贝/mL~5.5×¹⁰7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。     

非洲猪瘟病毒微滴数字PCR (ddPCR)方法的建立及应用

【目的】非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)能导致猪群高死亡率,从而造成严重的经济损失。因此,建立严密、高效的防控系统,包括灵敏、准确的诊断方法以及高效的预报预警机制等,以避免ASF传入我国。本文旨在建立一种新型而高灵敏度的ASFV微滴数字PCR(Droplet digital PCR,dd PCR)检测方法。【方法】针对ASFV K205R基因设计一对特异性引物和Taq Man探针,通过反应条件优化,建立了ASFV实时荧光定量PCR(q PCR)和dd PCR检测方法;并对两种方法的线性关系、灵敏性、特异性和重复性进行了评估,利用建立的ASFV检测方法对163份国内和进境的组织样本及血清样本进行检测,血清样本经商品化ASFV ELISA试剂盒复检,评估不同方法检测结果的符合率。【结果】建立的ASFV q PCR和dd PCR检测方法线性关系较好(R2≥0.998),dd PCR的最低检测限度可达到0.36拷贝,在20μL反应体系中约为10拷贝/反应,检测灵敏度是q PCR的10倍。ASFV dd PCR检测方法具有很高的特异性和重复性,不与其他猪常见病毒发生交叉反应。【结论】该方法灵敏度高、特异性强,可作为一种有效的分子生物学方法来诊断ASFV,为防止该病传入我国以及ASFV的实时监测提供新的技术储备,同时促进dd PCR技术在我国的发展和应用。     

快速鉴定B群链球菌及检测其耐药性方法的建立和初步应用

目的建立快速鉴定B群链球菌(group B Streptococcus,GBS)的同时检测其对克林霉素、红霉素耐药基因的多重PCR方法,并初步应用。方法建立多重PCR方法,同时扩增以下4个基因位点:GBS编码CAMP因子的基因cfb、大环类脂类耐药基因erm B和mef A/E、克林霉素耐药基因lin B。对该方法的引物质量浓度、Taq酶量和退火温度进行优化,确定多重PCR最适反应体系及最低检测限;将该方法用于91株GBS临床菌株的鉴定及其耐药性的检测,并评价其与常规PCR方法结果的一致性。结果多重PCR的最适反应体系,总量25μL:多重PCR mix212.5μL、多重PCR mix1Taq酶0.23μL、lin B-F和lin B-R引物0.4μmol/L、mef A/E-F和mef A/E-R引物0.2μmol/L、erm B-F和erm B-R引物0.12μmol/L、cfb-F和cfb-R引物0.08μmol/L、DNA 10~100 ng、不足量补入无菌去离子水。扩增程序为:94℃预变性60 s;94℃变性30 s、53℃退火90 s、72℃延伸30 s,共30个循环;72℃延伸10 min。最低检测限为20 pg/μL。多重PCR方法与常规PCR方法检测91株GBS临床菌株,cfb基因结果一致率为100%,erm B、mef A/E和lin B基因的Kappa值分别为0.938、0.956和0.935。结论建立的以GBS cfb、erm B、mef A/E和lin B基因为检测位点的多重PCR方法,可在鉴定GBS的同时检测其对克林霉素、红霉素的耐药性。     

基于TaqMan探针多重实时荧光PCR的肠道特殊菌群绝对定量方法的建立

本研究旨在建立对肠道主要共生菌的快速定量方法。根据细菌16S rRNA基因的保守序列并参考相关研究,设计针对总肠道菌群的通用引物和探针,以及针对双歧杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科的特异性引物和探针,采用引物设计工具(Primer-BLAST) 以及聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增以验证引物和探针的特异性。通过分子克隆技术,构建各目标菌属目的基因的重组质粒作为qPCR检测的标准模板,选择标准模板进行重复性实验,并计算组内和组间重复变异系数。用所建立的方法对不同年龄段的临床粪便标本进行3类细菌的检测,并初步分析这些菌群与增龄的关系。结果显示,引物和探针具有较高的特异性;各目的细菌标准曲线在一定范围内线性关系良好,总菌群或各目标菌属的线性范围分别为：总菌群2.9×10³～2.9×10¹²copies/μL、双歧杆菌3.1×10²～3.1×10⁹ copies/μL、肠球菌5.9×10²～5.9×10⁹ copies/μL、肠杆菌6.3×10²～6.3×10⁹ copies/μL,决定系数R²≥ 0.995;检测的最低拷贝数为总菌群7.5×10² copies/μL、双歧杆菌 46 copies/μL、肠球菌 37 copies/μL、肠杆菌 51 copies/μL;重复性实验变异系数在1.32%以下,具有良好的可重复性。对不同年龄段临床粪便标本检测的结果显示,肠球菌和肠杆菌含量随增龄呈增长趋势,且老年组含量显著高于青年组,但在高龄老年人中未发现肠球菌数量增加。双歧杆菌含量随增龄减少,且各组间差异显著,在高龄老年人中也未观察到双歧杆菌显著减少。结果提示,本研究建立了一种可供临床推广的菌群绝对定量方法,能够同时检测3类细菌和菌群总量,对于菌群定量研究具有实际意义。     

重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒qPCR检测方法的验证

目的 对重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR, qPCR)检测方法进行验证。方法 以基因组两末端的反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)为目的基因，对重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)的腺相关病毒进行qPCR检测。对该方法进行线性范围、重复性、准确度、中间精密度、定量限、耐用性和适用性验证。结果 AAV浓度在2×10²～2×10⁷ copies/μL范围内线性良好(R²>0.999);重复性验证CV<10%;准确度验证回收率在91%～114%;中间精密度验证CV<10%;定量限为100 copies/μL;耐用性验证CV<10%;并且3种不同重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)均未检出腺相关病毒。结论 重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)腺相关病毒qPCR检测方法的线性范围、重复性、准确度、中间精密度、定量限和耐用性均符合可接...     

RT-SHIV rt基因单拷贝PCR扩增方法的建立及初步应用

目的建立RT-SHIV病毒全长rt基因单拷贝PCR扩增方法,用于HIV-1 rt基因体内遗传与变异研究。方法 Oligo软件设计RT-SHIV rt基因特异性扩增引物,梯度稀释方法进行特异性和灵敏度筛选,进而优化退火温度和PCR反应最佳循环数等条件,建立rt基因PCR扩增方法;在此基础上将模板进行有限稀释,摸索rt基因单拷贝PCR扩增条件;使用该方法扩增感染猴体内RT-SHIV病毒rt基因,BioEdit软件进行基因序列分析。结果筛选得到一组巢式PCR引物,成功建立了RT-SHIV rt基因PCR扩增方法;当模板浓度为100 copies/μL时,扩增产物为单拷贝序列;测序结果显示RT-SHIV感染猴d266和d294血浆样本分别存在1处和6处氨基酸突变。结论本研究建立的全长rt基因单拷贝PCR扩增方法特异性好、灵敏度高、重复性强,可以应用于各类RT-SHIV病毒的全长rt基因分析。     

鸭源H6N6亚型AIV荧光定量PCR方法的建立及应用

[目的]为检测鸭感染H6N6亚型AIV后排毒及在组织器官病毒分布情况。[方法]通过建立H6N6亚型AIV荧光定量PCR检测方法,以H6N6亚型AIV M基因保守序列设计特异性引物,将分离到的H6N6亚型AIV病毒反转录为cDNA,进行pMD18-T-M基因克隆质粒构建,以其为标准品建立荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性和重复性试验,利用所建立的方法检测鸭感染H6N6亚型AIV后排毒及在组织器官病毒分布情况。[结果]该方法灵敏度高,最低检测到1.0×10^(1) copies/μL,从而可以得出拷贝数与Ct值之间的线性关系曲线表达式:Ct=-3.408×lg Copynumber+33.773(R^(2)=0.998),线性范围为1.0×10^(7)~1.0×10^(1)拷贝/μL,熔解峰的熔解温度在83℃左右。[结论]表明建立的鸭源H6N6亚型AIV荧光定量PCR检测方法,特异性强,重复性好,为后续实验研究提供了技术和数据支撑。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

7F型肺炎链球菌多糖竞争ELISA检测方法的建立

目的:建立检测7F型肺炎链球菌荚膜多糖的方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),检测发酵过程中多糖的浓度。方法:包被物为7F型肺炎链球菌多糖,竞争物为待测多糖,建立间接竞争ELISA方法,并验证其准确性和精密度。结果:最佳多糖包被质量浓度为2.5ug/ml,多糖抗体血清稀释度为1:8×104。在检测范围为2.5~30μg/m L时呈线性相关,7F的最低检测限为1.5μg/m L。回归方程为B/B0=-0.4075 Pn7F+0.7632,R2=0.9952.样品加标回收率为95.13%-105%。结论:本研究新建的ELISA方法准确性和精密度较好,能特异性地检测7F型肺炎球菌多糖。     

木麻黄SSR-PCR反应体系的建立与优化

为得到木麻黄SSR-PCR反应的最佳体系,以4个种(短枝木麻黄、山地木麻黄、粗枝木麻黄、细枝木麻黄)的24个无性系为材料,采用L₁₆(4⁵)正交设计对影响木麻黄SSR-PCR反应的4个因素(Taq酶、dNTP、Mg²⁺和引物)在4个水平上进行了优化,并利用直观分析和方差分析两种方法对PCR结果进行评价。结果表明:引物、Mg²⁺和dNTP均对木麻黄SSR-PCR反应结果有极显著的影响(P<0.01),影响程度由大到小为:引物>Mg²⁺>dNTP,而Taq酶对扩增结果无显著影响;确定了两种木麻黄SSR-PCR反应体系(体系6和体系15),体系6为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L^-1引物、1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.1 mmol·L^-1 dNTP、0.5 U Taq酶;体系15为1×PCR buffer、2ng模板DNA、0.5μmol·L^-1引物、1.75 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.2 mmol·L^-1 dNTP、1.25 U Taq酶,反应体系共10μL,不足部分用ddH2O补足。从节约成本和降低非特异性产物的角度考虑可将体系6作为最佳体系,体系15为备用体系;本试验所选荧光引物M26、M36的退火温度在52~62℃均可扩增出清晰明亮的条带。为简化操作步骤和减少非特异性产物,可选择60℃作为引物M26、M36的最佳退火温度。     

沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测*

根据沙门菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因序列,设计3对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果表明3对引物能特异地扩增出284bp、622bp、484bp的目的条带;最佳反应条件为沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的引物浓度分别为40nmol/L、40nmol/L、80nmol/L,Mg²⁺浓度2.4mmol/L,dNTP浓度200μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U,退火温度55.0℃~57.4℃之间;在此条件下多重PCR同时检测DNA的敏     

特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌

【目的】建立同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。【方法】将已报道的这3种基因的引物加入一个PCR反应管中,对引物浓度和退火温度进行优化,找到最佳引物比例和扩增条件。通过特异性验证、灵敏度验证以及方法间对比进行方法确认,其PCR产物使用全自动毛细管电泳分析系统进行分析。【结果】仅在91、269、485 bp处分别出现预期DNA扩增条带;纯培养条件下,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×101、6.6×102和6.6×101 CFU/mL;本底干扰物存在时,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×103、6.6×104和6.6×103 CFU/mL;模板DNA浓度检测限为1.36μg/L。检测进境海产品时,检测结果和FDA 2004标准结果一致,且更易辨认和判断。【结论】此检测方法的成功建立,为副溶血性弧菌及携带tdh和/或trh基因的致病性副溶血性弧菌的检测提供了一种准确、高效、便捷的分子技术手段。     

山羊传染性胸膜肺炎病原快速诊断方法的建立

为准确快速鉴定临床疑似山羊传染性胸膜肺炎(CCPP)病原,针对丝状支原体山羊亚种(Mmc)与绵羊肺炎支原体(Mo)16S rRNA基因设计两对特异性引物Ps/Pa、Ms/Ma,通过优化反应条件及体系,建立检测CCPP两种主要致病支原体的双重PCR方法,并检测了所建方法特异性、敏感性及临床应用。当引物、Mg2+及dNTP浓度分别为0.8 pmol/μL、1.5 nmol/μL、0.2 nmol/μL,Ps/Pa与Ms/Mo比例为1 1时,于54℃退火40 s,可最小检出Mmc与Mo核酸量分别为0.1 ng、0.01 ng,敏感性良好。通过特异性与临床疑似病例检测,证明所建方法具较好特异性,可初步应用于临床诊断。