PD-1核心启动子的获得及活性鉴定

目的:构建PD-1(programmed death receptor 1)全长启动子及不同截短体的报告基因,并对其转录活性进行检测。方法:通过PCR及双酶切方法,从人全血基因组DNA中获得PD-1基因编码序列,包含不同长度碱基的PD-1启动子序列,分别克隆到报告基因pGL3-Basic载体上,构建8个不同长度PD-1启动子的报告基因;用脂质体转染法将8个报告基因分别转染至Jurkat细胞系;采用双萤光素酶报告基因系统评估PD-1启动子的活性。结果:经PCR方法扩增出大小分别为1650、1450、1250、1128、874、674、474和274 bp的不同长度的PD-1启动子序列,测序正确(与GenBank报道一致),酶切鉴定正确;瞬时转染Jurkat细胞系后经报告基因检测,8个启动子均具有转录活性。结论:构建了PD-1启动子的报告基因,并证实均有转录活性,且以pGL3-1128活性最高,为PD-1的核心启动子,为进一步研究PD-1的转录调控奠定了实验基础。     

小鼠精胺氧化酶基因启动子结构和功能研究

目的:克隆和鉴定小鼠精胺氧化酶(mSMO)启动子DNA序列.方法:用Trizol试剂法从小鼠成纤维细胞中提取总RNA,应用5'-RACE法获得mSMO的转录起始位点;巢式PCR方法克隆含有mSMO启动子的DNA序列,并由此构建5'端系列截短的mSMO启动子荧光素酶报告质粒;将报告质粒瞬时转染Cos7细胞后,用荧光素酶分析法测定启动子活性.结果:确定mSMO基因至少有6个转录起始位点(+1,+4,+27,+31,+51,和+63),且均定位于外显子1中.克隆获得mSMO基因转录起始位点上游大约2.1kb的DNA片断,以此片段为基础构建了11个5'端系列截短的启动子报告质粒.报告基因分析证实,该上游DNA片段具有启动子活性,截短至-615和-176bp时,获得2个启动子活性峰值,截短至-373bp时启动子活性最低.结论:mSMO基因含有多个转录起始位点,其上游-176～+124bp为mSMO核心启动子区,-615～-176bp区为重要的转录调控区.     

人肝癌细胞LASP1 启动子的克隆及其核心调控区域的初步鉴定

目的:克隆人肝癌细胞的LASP1基因的启动子区域并找出该基因启动子的核心调控区域。方法:提取肝癌Hep G2细胞总DNA,PCR扩增不同长度的LASP1启动子片段,克隆至PGL3-Basic载体中构建重组表达载体PGL3-P1(2059 bp)、PGL3-P2(1123bp)、PGL3-P3(909 bp)、PGL3-P4(574 bp)和PGL3-P5(159 bp),转化入大肠埃希菌(E.coli)DH5α中,提取质粒经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆并测序。将构建的重组表达载体、PGL3-Basic载体分别与内参质粒PRL-Tk共转染Hep G2细胞,48 h后经双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测其活性。结果:PCR结果、双酶切结果以及DNA测序结果表明成功构建了LASP1启动子荧光素酶报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测结果显示,与PGL3-Basic组相比,重组载体PGL3-P1、PGL3-P2、PGL3-P3、PGL3-P4均具有较强的启动子活性(P0.01),其中,PGL3-P4的活性最强。结论:成功构建了人肝癌细胞不同截断长度的LASP1基因启动子荧光素酶报告基因载体,确定了LASP-1基因启动子的核心区域(-581 bp~-8 bp),为进一步研究LASP1基因在肝癌细胞中表达的关键调节因素及分子机制奠定了基础。     

EphA3基因启动子区域定位表达及活性分析

目的构建含有不同长度EphA3基因启动子片段的报告基因载体,研究其在293T细胞和MEF细胞中的转录活性。方法以Balb／C小鼠基因组DNA为模板,扩增不同长度的EphA3基因启动子片段,并克隆进入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic真核表达载体内。酶切鉴定及基因测序无误后,将重组质粒和pRL—CMV内对照质粒共转染293T和MEF细胞,分析不同长度的OhA3基因启动子片段的转录活性。结果酶切和测序鉴定表明表达载体构建成功,EphA3基因的核心启动子区域位于-279bp～＋110bp之间,在293T细胞和MEF细胞中其转录活性相似。结论成功构建了荧光素报告基因重组质粒,并确定了BphA3基因的核心启动子区域。     

人claudin-10基因启动子转录调控的初步分析

[目的]构建不同长度的人claudin-10基因上游启动子荧光素酶报告基因载体,并在LO2细胞中比较其活性。[方法]以人LO2肝细胞基因组DNA为模板,PCR扩增获得claudin-10基因5'侧翼序列,并将其插入p MD18-T载体;PCR扩增获得不同长度的claudin-10基因上游启动子区序列,构建p GL3-Basic系列荧光素酶基因报告载体。瞬时转染LO2细胞,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录活性。[结果]成功构建6个不同长度的人claudin-10基因上游启动子区(-1 451/+100bp、-1 022/+100bp、-1 005/+100bp、-677/+100bp、-377/+100bp和-108/+100bp)的报告载体;启动子活性实验结果表明:当claudin-10启动子片段从-1 005 bp截短至-677 bp,从-108 bp截短至+100 bp时活性显著下降(P0.05);其余截短时活性无改变(P0.05)。[结论]claudin-10启动子-1 005bp~-677bp和-108bp~+100bp区是claudin-10基因的主要转录调控区。     

人NDRG2基因截短体在pEGFP-C2真核表达载体中的表达和鉴定

目的:在pEGFP-C2真核表达载体中表达人NDRG2基因的截短部分并进行鉴定.方法:以含有人NDRG2基因的pGKBT7质粒为模板,通过PCR的方法扩增获得截短的人NDRG2基因,然后克隆入表达载体pEGFP-C2;以荧光显微镜观察和WesternBlotting方法对表达产物进行鉴定.结果:表达产物中在分子量67kD左右可见与目的蛋白分子量相符的条带,该条带可被Ndrg2单克隆抗体特异性识别.结论:构建了截短的人NDRG2基因真核表达载体,并在真核细胞中(HEK-293)获得成功表达.     

pax2启动子的克隆及其在人胚胎肾293T细胞中的转录活性

目的:克隆paired box2(pax2)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性。方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出pax2启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列。将重组的报告基因瞬时转染人胚胎肾293T细胞,检测pax2启动子活性。结果:测序结果显示扩增的pax2启动子序列正确;活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,雌激素受体α(ERα)能以剂量依赖的方式升高pax2报告基因的转录。结论:克隆了pax2启动子,为ERα共调节子的功能研究提供了重要基础。     

毛竹不同截短U3启动子的克隆及表达分析

具有明确转录起始位点的U3和U6启动子是CRISPR/Cas9技术中驱动sgRNA转录的重要元件。从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了2个PeU3启动子,均进行了3个不同长度的截短,长度分别为550、397和149 bp及561、392和152bp;并分别构建6个启动子驱动的GUS及LUC植物表达载体,再利用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法分别转化麻竹(Dendrocalamus latiflorus)愈伤组织和烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。结果显示,这些PeU3启动子总体都具有转录活性,不同PeU3启动子以及同一PeU3启动子不同截短时其转录活性不同,其中长度为397 bp的PeU3-1-2pro启动子活性最强,可为构建竹子CRISPR/Cas9基因组编辑体系提供更多理想的内源启动子。     

毛竹不同截短U3启动子的克隆及表达分析

具有明确转录起始位点的U3和U6启动子是CRISPR/Cas9技术中驱动sgRNA转录的重要元件。从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了2个PeU3启动子, 均进行了3个不同长度的截短, 长度分别为550、397和149 bp及561、392和152 bp; 并分别构建6个启动子驱动的GUS及LUC植物表达载体, 再利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法分别转化麻竹(Dendrocalamus latiflorus)愈伤组织和烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。结果显示, 这些PeU3启动子总体都具有转录活性, 不同PeU3启动子以及同一PeU3启动子不同截短时其转录活性不同, 其中长度为397 bp的PeU3-1-2pro启动子活性最强, 可为构建竹子CRISPR/Cas9基因组编辑体系提供更多理想的内源启动子。     

大鼠NKx6.1启动子克隆及特异性表达分析

旨在构建大鼠NKx6.1启动子的报告载体,验证转录因子T3R对NKx6.1启动子的调控活性。用PCR扩增大鼠脑组织NKx6.1的5'上游启动子片段2.4 kb,应用生物信息学方法预测该片段上潜在的转录因子T3R结合位点,根据不同的结合位点作系列截短,获得3段长度不等的启动子缺失片段,分别克隆到荧光素酶报告基因表达质粒(p GL3-Basic)上,构建相应的报告载体。将报告载体和T3R共转染大鼠星形胶质细胞(rat astrocytes,RA),并检测报告基因荧光素酶的活性。结果显示,成功构建大鼠NKx6.1启动子报告载体,双荧光素酶报告基因活性检测表明T3R对NKx6.1启动子有明显调控作用,其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高,即存在关键顺式调控元件。克隆并筛选出启动子核心区域,揭示了甲状腺激素对大鼠NKx6.1的表达调控机制。     

血管内皮细胞生长因子启动子突变体萤光素酶报告基因载体的构建

目的：构建含有不同片段血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的启动子的萤光素酶报告基因载体,并定位缺氧诱导因子1a（HIF-1d）结合VEGF启动子的区域。方法：以VEGF全长启动子为模板,PCR扩增VEGF启动子的不同片段,插入萤光素酶报告基因载体pGL4-basic,确定所扩增的DNA序列后,将其与HIF-1a表达载体共转染293T细胞,定位HIF-1a结合VEGF启动子的区域。结果：测序结果表明扩增的不同片段的VEGF启动子序列正确;萤光素酶活性实验表明,-1128～-728bp片段是HIF-1a与VEGF相互作用激活VEGF启动子转录活性的区域。结论：克隆了VEGF启动子5’端缺失突变体报告基因表达载体,为调控VEGF表达的转录因子的筛选及功能研究打下了良好基础。     

人Cuedc2启动子区的克隆与鉴定

目的:克隆并鉴定和分析人Cuedc2启动子,为进一步研究其转录调控机制和功能提供实验基础。方法:对Cuedc2基因翻译起始位点上游约2000bp的序列进行在线生物信息学分析,使用PCR技术扩增该序列并测序,将扩增获得的该片段定向克隆入PGL-3basic载体中,构建荧光素酶报告基因质粒Cuedc2-luc。荧光素酶分析检测启动子的活性。结果:本实验成功构建了含有Cuedc2基因启动子序列的荧光报告系统,经体外验证该报告基因重组载体具有转录活性。结论:本实验所构建的Cuedc2基因启动子报告基因载体,为进一步研究Cuedc2基因的转录调控及其功能奠定了基础。     

端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因启动子的克隆及活性分析

目的：克隆端粒、端粒酶结合因子hPinx1基因的启动子,分析并鉴定其活性调控元件。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增出hPinx1启动子,构建到萤光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在HepG2细胞中检测其活性。结果：克隆了hPinx1基因转录起始位点上游4661bp且序列正确;活性分析表明hPinx1启动子含有多个调控元件,其中核心序列位于530bp内,在1329-2174bp间存在正调控序列,在2174-4661 bp间存在负调控序列。结论：构建的hPinx1启动子具有活性,为hPinx1的功能研究提供了重要基础。     

内皮细胞特异性启动子pvWF和pVE的克隆及表达

目的:克隆并验证内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)特异性启动子,为转染人胚胎干细胞(h ESC)后实时监测ECs的定向分化情况以及利用干细胞实施血友病A的基因治疗研究提供基础。方法:通过酶消化法原代分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs),结合RT-PCR和免疫荧光验证分离后的HUVECs表达内皮细胞特异性标志基因血管性血友病因子(v WF)和血管内皮钙粘素(VE-cadherin/CDH5)。抽提HUVECs的g DNA,通过PCR扩增内皮细胞特异性表达基因v WF和VE-cadherin转录起始位点上游不同大小的启动子片段,将其取代报告基因载体p EGFP-N1中的广谱启动子CMV,构建4个质粒,即pv WF-1、pv WF-2、p VE-1、p VE-2,分别转染HUVECs和h ESCs,48 h后观察并比较各启动子片段启动绿色荧光蛋白GFP表达情况,筛选最具特异性及转录活性的启动子片段。结果:通过酶消化法,本研究成功分离出具有典型上皮样细胞的HUVECs。RT-PCR和免疫荧光结果表明HUVECs特异性表达v WF和VE-cadherin。酶切及测序证实所构建的4个含ECs特异性启动子片段的质粒与理论序列相符,通过核转染至HUVECs及h ESCs后,48 h后观察到所克隆的VE-cadherin 2105bp启动子片段具有内皮细胞表达的特异性和较强的转录活性。结论:本研究成功筛选出具有内皮细胞表达特异性及较强转录活性的启动子片段。     

Cloning of rfaG, B, I, and J genes for glycosyltransferase enzymes for synthesis of the lipopolysaccharide core of Salmonella typhimurium.

R-prime plasmids carrying the pyrE-rfa-cysE region of the chromosome of Salmonella typhimurium were isolated by using the vector pULB113 (RP4::mini-Mu). One of the R-prime plasmids was used as a source of DNA to clone the rfa genes for lipopolysaccharide synthesis to pBR322. The following three hybrid plasmids were constructed: pKZ15, with a 4.0-kilobase EcoRI fragment of S. typhimurium DNA, containing the rfaG gene; pKZ27, a 9-kilobase BglII fragment with the rfaG, rfaB, and rfaI genes; and pKZ26, a 7.7-kilobase HindIII fragment with the rfaG, rfaB, rfaI, and rfaJ genes. We propose that these cloned genes code for four glycosyltransferases used for synthesis of the lipopolysaccharide core region (rfaG for glucosyltransferase I; rfaI for galactosyltransferase I; rfaB for galactosyltransferase II; and rfaJ for glucosyltransferase II). For all four genes, mutants which lacked the appropriate enzyme activity were complemented by the plasmids to give completed core lipopolysaccharide with O (somatic) side chains; for rfaG, rfaB, and rfaI, mutants gave restored or even amplified levels of the appropriate glycosyltransferase in in vitro assays. We show that the order of genes in the region is pyrE-rfaG-(rfaB-rfaI)-rfaJ-rfaL-rfaF -cysE.