α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn's组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn's组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT.用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性.结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含 0.54 mg功能活性α1-AT.可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT.     

高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(a_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。     

猪血浆α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-Antitrypsin,简称α_1-AT)是由肝细胞分泌的一种糖蛋白,是存在于动物血液中的一种重要的蛋白酶抑制剂,它能抑制多种丝氨酸类蛋白水解酶,占血浆胰蛋白酶抑制总活力的90％以上。α_1-AT通过调节蛋白水解酶的活性而参与机体的一系列生理活动,如血液凝固、纤维蛋白溶解、组织激肽释放、细胞融合、大分子装配和免疫反应等过程,对防止组织过度损伤有重要作用。目前国际上对人的α_1-AT研究较多,而对猪α_1-AT的研究甚少,仅见     

高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。α_1-AT在血浆中含量较高,在组织中广泛存在,对维持机体正常生理功能,防止组织过度破坏起重要作用。本文报道经我们改良的高纯度α_1-AT提取方法、抗血清的制备及其火箭免疫电泳定量测量方法。一、材料与方法 1、α_1-AT、蛋白质测定方法α_1-AT按Eriksson法测定胰蛋白酶抑制容量(TIC)。结晶胰蛋白酶为Sigma产品,胰蛋白酶的特异性     

体外重构STUB1介导α-1抗胰蛋白酶突变体Z蛋白泛素化修饰反应体系

α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein, ATZ)是引发α-1抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency, AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义。STUB1是一种重要的E3泛素连接酶,参与调节多种蛋白质的泛素化修饰。然而,STUB1是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确。本研究首先将ATZ和STUB1的编码基因克隆到pET28a质粒,构建了这2个蛋白的表达质粒。随后,将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达。通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白,并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性。利用纯化的ATZ和STUB1重组蛋白,构建了一个体外泛素化修饰反应体系。实验结果显示,在ATP、E1泛素激活酶和E2泛素结合酶的协同作用下,STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰。本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法,并确认了STUB1介导ATZ的泛素化修饰功能,推进了对α-1抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解。     

α_1抗糜蛋白酶

<正> 血浆中含有几十种蛋白质。其中含量最多的是清蛋白,其次为免疫球蛋白。居于第三位的是一组蛋白酶抑制物,关于它们的生物学意义,有些至今尚未明确。引起人们对这类血浆蛋白质的兴趣始于60年代初。当时有人报道α_1抗胰蛋白酶(α_1—AT)的缺乏与肺气肿的发生有关。该作者用琼脂电泳法检查了六例肺气肿思者的血清,发现在α_1区缺少一种成分,免疫电泳证实它是α_1—AT。直到1970年,西德的N.Heimberger采用了一种特别的生化分析方法,才首次比较系统地分离和鉴定了几种存在干血浆内的蛋白酶抑制物。这个方法把电泳和酶     

上海地区胃癌病人运铁蛋白(Tf)、组特异性成分(Gc)、α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型分布的研究

用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析了上海地区202例汉族胃癌病人及202例正常对照组的运铁聋白(Tf)和α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型的分布,发现胃癌组Tfc_1c_1纯合子频率(0.3713)和Tfc_1基因频率(0.5718)显著低于对照组(分别为0.5149和0.6782),均为p<0.01,胃癌组Tfc_2c_2纯合子频率(0.2228)和Tfc_2基因频率(0.4019)显著高于对照组(分别为0.1436,p<0.05和0.2970,p<0.01),胃癌组和对照组的α_1-抗胰蛋白酶亚型分布无显著差异。用薄层聚丙烯酰胺等电聚焦结合免疫固定分析了上海地区200例汉族胃癌病人和200例正常对照组的组特异性成分(Gc)亚型分布,发现胃癌组Go1F表型频率(0.22)和Gc1F基因频率(0.4375)均显著高于正常对照组(分别为0.14和0.3600,均为p<0.05)。     

赤芝孢子粉中一个葡聚糖的分离纯化与结构鉴定

从破壁的赤芝 (Ganodermalucidum (Fr.)Karst)孢子粉中分离纯化到一个水溶性的、以 1,4连接的D_葡萄糖为主链、在 6位接 1,6连接葡萄糖的α_D 葡聚糖。高效分子排阻色谱测定 ,重均分子量为 9.3× 10 3 ,[α]2 1D = 174.2° (c 0 .87,H2 O)。通过糖组成分析 ,甲基化反应 ,乙酰解及一维和二维核磁等光谱解析 ,确定其结构如下 :　　　　　　　　　　　　　　　　α_D_Glcp_(1→ 6 )_α_D_Glcp_(1→ 6 )_α_D_Glcp　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 6　　　　　　　〔→ 4)_α_D_Glcp_(1→ 4)_α_D_Glcp_(1→ 4)_α_D_Glcp_(1→ 4)_α_D_Glcp_(1→ 4_)_α_D_Glcp_(1→〕n     

海藻中两种纤溶活性化合物的分离与结构鉴定

采用氯仿-甲醇有机溶剂提取、常压硅胶柱层析等方法进行分离纯化,从微劳马尾藻的提取物中分离纯化了6个化合物;根据核磁共振谱分析及文献解析化合物B、D分别确定为棕榈酰基．油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油和肉豆蔻酰基-油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油;使用酶标仪体外测定化合物的纤溶活性,发现化合物B使纤溶作用提高了10％～30％,化合物D的纤溶促进作用弱于化合物B;分离纯化的纤溶促进化合物B和D属于甘油糖脂类化合物。本文首次从微劳马尾藻分离得到了肉豆蔻酰基．油酰基-3-O-α-D-吡喃葡萄糖基甘油。     

纯化小麦α-淀粉酶的亲和层析法

纯化α-淀粉酶有多种方法。Mac Gregor等以及Kruger和Tkachuk分别应用羧甲基纤锥素离子交换层析与丙酮分部、糖元沉淀和离子交换层析,各自从大麦及春小麦分离了α-淀粉酶。Tkachuk又发展了以α-环化糊精为配基的α-淀粉酶分离纯化的亲和层析法。由于亲和层析法简便、快速、高效,因而获得了广泛的应用。我们以β-环化糊精(β-Cyclodextrin)为配基,分离纯化了小麦α-淀粉酶。现介绍如下。     

α1-抗胰蛋白酶的缺乏与治疗

α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-antitrypsin deficiency,AATD)是遗传性疾病,可引起肝脏疾病,也与早发型肺气肿等肺部疾病有关。编码α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)的基因具有复杂的单核苷酸多态性,并以常染色体共显性方式遗传。临床上,以混合人血浆为来源的静注AAT可提高AATD患者的血清AAT水平。除这种增补疗法外,新的治疗方法也在不断发展,包括基因治疗及干细胞治疗等。     

草鱼α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与表达分析

采用RACE技术获得α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长序列为1 469 bp,开放阅读框为1 329 bp,可编码442个氨基酸。5′非编码区长19 bp,3′非编码区长121 bp。核苷酸序列分析表明,在N端可能存在一个由1～21位氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是虹鳟;在系统进化上,与在斑马鱼、虹鳟共聚为一个大支。用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼α1-抗胰蛋白酶基因在不同组织中的表达分布。结果显示:正常情况下,草鱼α1-抗胰蛋白酶在肝脏表达最丰富,在脾脏、前肾、前肠、中肠、后肠和也有少量表达;细菌诱导下,肝脏中表达最强,前肾、脾脏、肠道中表达均明显提高,心脏和后肾中也出现较高表达。提示α1-抗胰蛋白酶可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答。     

人类精浆和卵泡液中有胸腺素α_1

过去已在胸腺中分离到几种激素样因子,胸腺素α_1(Tα_1)为其中的一种,它位于胸腺上皮细胞。美国Naz 等首次报告人类精浆和卵泡液中存在高浓度 Tα_1。19名男性精浆中 Tα_1浓度变异范围为614-2604pg/ml(均值±SD 约为1682±454 pg/ml)。Tα_1浓度与射出精液中精子总数和精液体积间都显示相关。不育男性 Tα_1浓度低,精子数目少,精子运动减少,精浆体积小。取自10名不育女性24个卵泡的卵泡液中,Tα_1浓度变异范围为1019至6384pg/ml(均值±SD     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.     

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。     

大鼠肝癌中α_2-巨球蛋白等几种分泌性蛋白基因表达的变化

用Northern blot方法对二乙基亚硝胺所诱发的大鼠肝癌中内源性蛋白酶抑制因子α_2-巨球蛋白(α_2-M)、非特异性免疫抑制剂α_1-酸性糖蛋白(α_1-AGP)及雄性激素正调控的α-2u球蛋白(α-2u)三种分泌性蛋白基因表达情况进行了分析。结果表明在大部分(14/16)肝癌样品中α_2-M RNA水平显著降低;而α_1-AGP RNA水平显著高于正常对照水平;α-2u RNA水平明显下降,但在某些雄性大鼠肝癌样品中该基因却有一定程度的表达。这些结果说明,一些肿瘤宿主血浆中α_2-M水平的显著下降及α_1-AGP水平的明显升高分别是由于基因表达活性的下降及升高所致。α-2u基因表达的异常提示,在癌变过程中机体的内分泌功能发生了某些变化。     

B22Asn人胰岛素突变体的研究

通过ＤＮＡ定点突变法将人胰岛素Ｂ２２Ａｒｇ改造成Ｂ２２Ａｓｎ,去除其一级结构中碱性蛋白酶位点,以期提高胰岛素在体内的稳定性,突变体基因克隆到表达载体ＰＢＶ２２０中,在Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中进行表达,分离纯化后的表达产物经胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ联合作用获得重组Ｂ２２Ａｓｎ－人胰岛素,该突变胰岛素具有抗胰蛋白酶水解能力,但是其与受体的结合能力只有标准猪胰岛素的１２．４％,胰岛素结构中的Ｂ２２Ａｒｇ可能在     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

紫球藻藻红蛋白的分离纯化及光谱学特性

采用4℃反复浸提、离心、硫酸铵沉淀、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换柱层析,从紫球藻（Porphyridium cruentum Naegeli）冻干粉中分离纯化藻红蛋白,分离纯度达到4．85,总收率51．9％;经羟基磷灰石柱层析纯化,藻红蛋白纯度达到5．10,总收率34．0％,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示1条带。所分离纯化的藻红蛋白含有3个亚基（α、β、γ）,在可见光区545nm和560nm处有2个吸收峰,在498nm处有1个吸收肩峰。实验结果说明所分离纯化的藻红蛋白纯度符合要求。     

纯化试验设备完成 明年临床试验在动物工场制造的医药

英国PPL Therapeutics公司最近完成纯化动物工场生产蛋白的试验设备,已进引用重组山羊生产人α1抗胰蛋白酶(AAT)的试验。英公司表示与德国Bayer公司合作于96年下半年在EU着手作为囊胞性纤维化治疗药的AAT的临床试验。