人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外配体结合域的筛选及其结构分析

 血管内皮生长因子受体 Flt- 1胞外区具有 7个免疫球蛋白样的袢 (Ig- like loop) ,氨基端 3个loop负责与其配体 VEGF的结合 .为了寻求能与配体结合的更小的 Flt- 1片段 ,在对 Flt- 1胞外前3个 loop氨基酸组成和晶体结构分析的基础上 ,应用酵母双杂交系统对 Flt- 1的配体结合域进行筛选 .利用 PCR技术 ,从人胎盘 c DNA文库扩增出 4个截短的 Flt- 1 c DNA,分别含胞外第 2 ,1 - 2 ,2 - 3和 1 - 3个 loop,构建酵母双杂交系统融合表达质粒 ,并将 p GBT9/h VEGF165与 p GAD42 4 /Flt- 1 s两两配对转化酵母菌 SFY52 6,采用滤纸法和液体培养定量检测法对阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析 .结果显示 ,Flt- 1胞外 loop 2 - 3与 loop 1 - 3的配体结合能力相差不大 ,loop 1 - 2的结合力较弱 ,单独第 2个 loop无配体结合能力 .     

VEGF受体KDR结合区的克隆与表达

KDR是血管内皮生长因子(VEGF)的主要受体之一,它在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用.为了获得人重组的有VEGF结合活性的KDR,通过RT-PCR从人胎儿脐静脉内皮细胞（EC）扩增出编码KDR胞外Ⅰ～Ⅳ区片段,将其克隆在谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白表达载体pGEX2T中,并在大肠杆菌中获得稳定表达.表达的融合蛋白GST-KDR以包涵体形式存在,其分子质量约66 ku左右.经碱变性法大量提取,及制备胶电泳获得纯化的KDR,为进一步的研究奠定了基础.     

人血管内皮生因子受体配体结合域

利用ＰＣＲ技术,从人胎盘ｃＤＮＡ文库扩增出４个截短的人血管内皮生长因子受体（Ｆｌｔ－１）ｃＤＮＡ,分别含胞外第２、１－２、２－３、１－３个环,应用酵母双杂交系统对Ｆｌｔ－１的配体结合域进行了研究,结果表明不仅其胞外１－３环能与ｈＶＥＧＦ１６５结合,比其更小的片段２－３环也具有与配体结合的能力。进一步构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／Ｆｌｔ－１（１－３）和ｐＰＩＣ９Ｋ／Ｆｌｔ－１（２－３）,转化Ｐｉｖ     

用腺相关病毒载体介导人血管内皮生长因子受体KDR胞外区基因的表达

新生血管大量形成在实体瘤的生长和转移中起着关键的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是介导肿瘤血管生成的最主要因素。从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体KDR胞外区cDNA片段。将获得的受体基因克隆到AAV基因治疗载体pSNAV中,得到重组质粒pSNAV/KDR。重组质粒转染BHK细胞,加入辅助病毒后,获得了表达目的蛋白的重组AAV。重组病毒表达的KDR在体外实验中具有与VEGF结合的活性。在体内实验中,重组AAV感染的黑色素瘤细胞在小鼠中形成肿瘤的血管化程度明显低于对照组。     

血管内皮生长因子受体--结构与功能

血管内皮生长因子 (VEGF)的生物学效应是通过其特异的膜受体介导实现的。迄今发现VEGF有三种受体 ,受体的结构、功能 ,及VEGF的信号转导途径各不相同 ,也一直是VEGF研究的热点。本文主要综述了这方面的进展。     

血管内皮生长因子受体的结构与功能

血管内皮生长因子(VEGF)受体是存在于血管内皮细胞,介导内皮细胞增殖分化的跨膜受体.研究较多的有两种VEGF特异受体:Flt和KDR.Flt和KDR的基因结构及染色体定位已基本确定,这二者均属RTK Ⅲ型受体,结构相似.细胞外区均有7个类似免疫球蛋白结构,细胞内区催化域均有酪氨酸激酶插入区.当VEGF与受体结合时,引起受体自身的磷酸化,发生细胞内反应.在血管发生与生长、创伤修复、炎症、肿瘤和某些血管疾病中起重要作用.     

血管内皮生长因子家族及其受体与肿瘤血管生成研究进展

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),又名血管通透性因子(vascular permeability factor,VPF)是重要的血管生成正性调节因子,是目前抗癌治疗的研究靶点之一。现已发现的VEGF家族成员包括VEGF—A、VEGF—B、VEGF—C、VEGF—D、VEGF—E和胎盘生长因子(placenta growth factor,PLGF)。VEGF的受体有VEGFR—1(fit—1)、VEGFR-2(flk-1／KDR)、VEGFR-3(fit-4)、neuropilin(NPR1／NPR2)。该家族的成员可以选择性地增强血管和／或淋巴管内皮细胞的有丝分裂,刺激内皮细胞增殖并促进血管生成,提高血管特别是微小血管的通透性,使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中,促进新生毛细血管网的建立,为肿瘤细胞的生长提供营养等。作者对VEGF家族成员及其受体的理化特征、VEGF与肿瘤的关系、VEGF抑制剂的研制作一综述。     

血管内皮生长因子受体信号转导通路与肿瘤血管生成

血管内皮生长因子是促进血管生成的重要调节因子.它能促进内皮细胞增殖、迁移,阻止内皮细胞凋亡、管腔网状结构退化,增加血管渗透性.所有这些作用都是通过血管内皮生长因子受体信号转导通路实现的.它们在肿瘤血管生成、肿瘤生长中起着重要的作用.以血管内皮生长因子受体信号转导通路为靶点是开发肿瘤血管生成抑制剂的理想策略.     

利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域

The vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 is charaterized by seven Ig-like loops within the extracellular domain. To identify which part is responsible for ligand binding, four cDNA clones coding for truncated Flt-1 mutants consisting of loop 1, 1-2, 2-3 and 1-3 were obtained by PCR from human cardiac cDNA library and inserted into the vectors of the yeast two-hybrid system, with VEGF cDNA on the partner plasmid. The paired plasmids were transformed into yeast strain SFY526, and tested by filter membrane method and β-galactosidase activity. The results showed that Flt-1(1-2)、Flt-1(2-3) and Flt-1(1-3) all were able to bind VEGF, of which Flt-1(1-3) showed the highest binding affinity, but no binding of VEGF was observed with Flt-1(2) and VEGF.     

血管内皮细胞生长因子受体(KDR)的分子克隆与原核表达

血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）是特异的血管内皮细胞促分裂素,它主要通过相应受体（ＫＤＲ）刺激血管内皮细胞增殖．ＶＥＧＦ及其受体在肿瘤血管形成中起重要作用．通过逆转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）成功地从人脐静脉内皮细胞扩增出编码ＫＤＲ胞外ＶＥＧＦ结合区的ＤＮＡ片段,将该片段克隆在谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中,获得在大肠杆菌Ｊｍ１０９的稳定表达．表达的不溶性融合蛋白可经碱变性法大量提取,为后续的研究工作奠定了基础．     

KDP胞外502～764位氨基酸基因合成、表达及功能鉴定

应用基因搭桥法及 Taq酶聚合反应合成了编码人血管内皮生长因子受体 - ( h VEGFR- ,KDR)第 50 2～ 764位 2 62个氨基酸的基因片段 .DNA序列分析表明 ,合成的 786bp的基因片段与文献报道的 KDR相应 c DNA序列完全一致 .将该基因与原核融合蛋白表达载体 p GEX- 3X重组 ,在大肠杆菌 JM1 0 9中表达了 GST- KDR2 62融合蛋白 ,表达量约占菌体总蛋白的 35% .表达产物依次经包涵体分离、变性、复性、亲合层析纯化和 Xa因子酶解 ,获得了 KDR2 62目的蛋白纯品 .GST-KDR2 62融合蛋白和纯化产物经 Western blot分析 ,两者均可被 VEGF1 65特异性识别 ,前者分子量约 56k D,后者分子量约 30 k D;这两种蛋白用 VEGF1 65及其抗体进行的 ELISA分析结果均显示阳性 ,并有剂量依赖关系 ,而用 Xa因子酶解 GST- KDR2 62融合蛋白获得的 GST和空载体诱导产物对照均为阴性 .以上结果表明表达的 KDR2 62蛋白可特异性地与 VEGF结合 .     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区cDNA在毕赤酵母中的表达和鉴定

将编码血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区1-3 loop 316个氨基酸残基的cDNA插入到含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的Pichia pastoris酵母载体中,构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3),转化酵母宿主菌GS115,筛选His⁺Mut^s表型转化子,经摇瓶培养,1%甲醇诱导表达4 d后,SDS-PAGE结果显示,培养上清中Flt1(13)表达量达总蛋白的30%以上。ELISA及Western blot实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有结合VEGF的能力和抑制VEGF对HUVEC细胞的促增殖功能。     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选     

血管内皮细胞生长因子受体Flt-1胞外区基因的克隆及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

从原代培养的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取细胞总RNA,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法得到VEGF受体Flt-1胞外区前3个IgG样区域cDNA片段(Flt-1n3).将获得的受体基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组质粒pcDNA3.1/Flt-1n3,通过脂质体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO),用G418筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞克隆.经固相结合实验筛选得到表达与VEGF特异结合的目的蛋白的细胞克隆,细胞测活结果表明,表达产物具有抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性.鸡胚测活结果表明,CHO细胞表达的r Flt-1n3能抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管形成.     

HER2胞外段的克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从人乳腺癌细胞系SK-BR-3中克隆出人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factorreceptor 2,HER2)基因的胞外段,并插入到表达载体pET-30a中,得到重组表达载体pET30-HER2(Ex)。将该载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,加入IPTG进行诱导表达,成功获得HER2胞外段蛋白。分别提取培养液上清、大肠杆菌周质腔、细胞质可溶性及不可溶性组分蛋白进行SDS-PAGE电泳分析,确定目的蛋白定位于大肠杆菌细胞质包涵体中。通过改变诱导温度、诱导物浓度、诱导起始菌体密度和诱导时间,寻找最佳表达条件,使目的蛋白的表达量达到最高。结果表明,在37℃下,OD600达到1.0时,经终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导4 h,目的蛋白的表达量最高。将重组表达菌进行超声破碎,分离出包涵体组分,经Ni2+亲和层析纯化后获得了纯度>90%的HER2胞外段蛋白,从而为抗HER2抗体的制备及肿瘤疫苗的研究奠定了基础。