DNA碱基编辑器在微生物中的研究进展

在众多生物中利用具有切割作用的CRISPR/Cas9系统与非同源性末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复系统或同源性末端连接(homology-directed repair,HDR)修复系统共同完成基因编辑工作都有报道。但是由于NHEJ的不精确性以及一些微生物中HDR效率较低导致生物体死亡限制了该工具的发展。基于CRISPR/dCas9系统构建而成的DNA碱基编辑器作为一种编辑工具,可靶向地实现碱基之间的转换,且不导致微生物死亡。DNA碱基编辑器在微生物中已经实现靶向编辑工作,可以同时多个位点进行编辑,同时可以利用该工具将编码氨基酸的密码子转化为终止密码子,提前终止翻译过程实现对基因的失活。本文主要对DNA碱基编辑器的作用原理,发展历程以及在微生物中的应用做了概述,最后提出了该工具存在的一些不足之处,并结合相关研究展望了未来的研究方向。为在微生物中开发与利用DNA碱基编辑的研究提供了思路。     

基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统

近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。为进一步提高碱基修改的效率和精确度,2016年研究者们利用CRISPR/Cas9识别特定DNA序列的功能,结合胞嘧啶脱氨酶的生化活性发明了将胞嘧啶高效转换为胸腺嘧啶(C>T)的嘧啶单碱基编辑系统(base editor)。这一系统虽然能精准实现嘧啶直接转换,大大提高精确基因编辑效率,但美中不足的是无法对嘌呤进行修改。近期,Nature报道了将细菌中的tRNA腺嘌呤脱氨酶定向进化形成具有催化DNA腺嘌呤底物的脱氨酶,将其与Cas9系统融合发明了具有高效催化腺嘌呤转换为鸟嘌呤的新工具—腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs, adenine base editors)。本文总结了单碱基编辑工具的发展历程和最新研究进展,着重介绍ABEs的研发过程,并对单碱基编辑工具今后的应用方向和研发方向进行展望。     

单碱基编辑技术的原理、发展及其在家畜育种中的应用

基因编辑技术CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)在家畜育种领域得到广泛应用,但其效率低下,且存在非靶向切割、安全性较低等问题,极大地限制了家畜育种中单碱基突变的引入。单碱基编辑(single base editing)作为一种最新的基因编辑工具,能够在不导入双链断裂的情况下直接进行碱基的替换,具有编辑效率高和特异性强的特性,为家畜育种的精确基因修饰提供了一种更简单、更有效的方法。本文主要介绍了单碱基编辑系统的原理及发展进程和碱基编辑技术在家畜育种中的应用,以期为单碱基编辑器在家畜育种中进一步优化和选择应用提供参考。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术及其在生物医学和农业中的应用

近年来,基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas)的基因编辑技术飞速发展,该系统可以利用同源定向重组(Homology directed repair,HDR)来完成其介导的精准编辑,但效率极低,限制了其在农业和生物医学等领域上的推广应用。基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑技术作为一种新兴的基因组编辑技术,能在不产生双链断裂的情况下实现碱基的定向突变,相对于CRISPR/Cas介导的HDR编辑具有更高的编辑效率和特异性。目前,已开发出了可将C碱基突变为T碱基的胞嘧啶碱基编辑器(Cytidine base editors,CBE),将A碱基突变为G碱基的腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors,ABE),以及可实现碱基任意变换和小片段精准插入和缺失的Prime编辑器(Prime editors,PE)。另外,能实现C到G颠换的糖基化酶碱基编辑器(Glycosylase base editors,GBE)以及能同时编辑A和C两种底物的双碱基编辑器也已被开发出来。文中主要综述了几种DNA碱基编辑器的开发历程、研究进展及各自优点和局限性;介绍了DNA碱基编辑技术在生物医学以及农业中的成功应用案例,以期为DNA碱基编辑器的进一步优化和选择应用提供借鉴。     

碱基编辑系统研究最新进展及应用

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homology directed recombination,HDR)修复途径,且效率极低.基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(...     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术研究进展*

基于CRISPR/Cas系统出现的单碱基编辑技术可以实现高效且简便的单个碱基的替换编辑,其原理是将胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase)或腺苷脱氨酶(adenosine deaminase)与Cas9n(D10A)形成融合蛋白,通过CRISPR/Cas精准识别和定位DNA上的靶位点后,利用胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶将靶点距离sgRNA位点基序(protospacer adjacent motif,PAM)序列端的4~7位的单个碱基发生单碱基转换或颠换。对基于CRISPR/Cas系统的单碱基编辑技术发现的历史、组成和分类、工作原理进行了概述,并总结了该系统最新进展及应用。     

碱基编辑技术的发展与应用

碱基编辑技术,以CRISPR/Cas系统为平台,引导胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶至特定的基因组靶点,产生靶向性的C至T或者A至G的碱基转换。自碱基编辑技术问世以来,全球多个科研团队通过优化改进得到了一系列高精准性、广靶向性、小编辑框、普适性的碱基编辑器。在应用方面,碱基编辑器能够在人体细胞、动植物细胞以及胚胎中进行高效的碱基转换,在治疗人类遗传病、构建动物疾病模型、植物育种等方面具有巨大的应用潜能。本文就碱基编辑技术的发展、优化和应用等方面进行综述和展望。     

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51.07U/mg蛋白。通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH和温度分别为7.5和40℃,且在40℃下维持稳定。     

腺嘌呤核苷脱氨酶及核苷运转系统对精子运动的调节作用

 腺嘌呤核苷(ADO)和它的类似物2-Cl-ADO对牛附睾尾部精子的运动有刺激作用,为了探讨ADO及其类似物对精子运动调节作用的机理,我们从ADO受体,核苷运转系统(NTS)及腺苷脱氨酶(ADA)三个方面对牛附睾尾部的精子进行了研究。我们发现腺苷受体不存在于牛精子膜上,但ADA和NTS以膜蛋白的形式结合在精子膜上,并对精子体内的ADO浓度起调节作用。我们的结论是ADO及其类似物对牛精子运动的调节作用是首先通过精子膜上的ADA和NTS影响精子体内的ADO浓度,进而ADO又通过调节钙离子浓度刺激牛精子运动。     

线粒体基因组靶向编辑研究进展

线粒体作为细胞中重要的细胞器,其携带有自身的基因组。线粒体基因组发生突变后,可能导致人类疾病。开发靶向线粒体基因组的新型基因编辑工具在疾病治疗和疾病模型构建中具有重要意义。该文总结了线粒体基因编辑领域的进展,特别是近期以DdCBE和TALED为代表的重大进展;同时,也指出目前线粒体基因编辑工具仍然有一些缺点。该文拟为新型线粒体基因编辑工具的研发提供参考。     

以减毒沙门氏菌为载体的口服胞嘧啶脱氨酶基因治疗小鼠肿瘤

通过电转化法将真核表达载体EGFPN1和pLCDSN导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261中,经由胃管饲于C57BL／6和BALB／c小鼠。6周后接种Lewis和4T1肿瘤细胞,待种瘤增至直径为10mm左右,辅以‘腹腔注射5－氟胞嘧啶治疗。通过流式细胞仪、共聚焦显微镜和PCR等方法,在小鼠的肝脏、脾脏、小肠、肾脏、肿瘤等组织器官中均可检测到胞嘧啶脱氨酶基因的整合,绿色荧光蛋白在小鼠的脾脏和肿瘤中表达最强,其他组织表达甚弱,利用胞嘧啶脱氨酶／5－氟胞嘧啶系统进行治疗的小鼠肿瘤生长较其他组织显著受抑（P＜0.01),小鼠的生存期明显延长（P＜0.01),未观察到明显的毒副作用。     

五个汉族及三个少数民族人群的腺苷脱氨酶分布

用淀粉胶电泳及特异性酶染色方法测定了五个汉族及三个少数民族人群的红细胞腺苷脱氨酶(ADA)分布。ADA~2基因频率分别为:成都汉族0.0492,漳州汉族0.0240,哈尔滨汉族0.0386,贵阳汉族0.0343,西安汉族0.0302,布依族0.0584,瑶族0.0190,哈尼族0.0136。南方人群的ADA~2基因频率一般低于北方人。未发现罕见变异型。     

人胃腺苷脱氨酶的分离纯化及性质研究

用硫酸铵分级沉淀、ＤＥＡＥ－纤维素离子交换层析、免疫亲和层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶柱层析从人胃组织中提取出腺苷脱氨酶。酶纯化１９３２４倍,比活力为５７９７Ｕ／ｍｇ蛋白。提取酶液经ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和等电聚焦只呈现一条区带。测得该酶的分子量为４１．２ｋＤ,等电点为ｐＨ４．８,氨基酸组成分析表明该酶由３８８个氨基酸残基组成,Ｎ端氨基酸为精氨酸。酶的最适ｐＨ为６．５,ｐＨ小于５．０或大     

61例肺结核影像学表现及血清腺苷脱氨酶检测

目的:分析近期肺结核的临床表现、影像学特点,探讨肺结核各期与血清腺苷脱氨酶的关系.方法:回顾性分析61例肺结核患者的临床表现、胸部x线及CT扫描特点;将所有病例按活动性及转归分为进展期、好转期、稳定期,另随机抽取20例正常志愿者做对照组,分析比较各组血清腺苷脱氨酶水平.结果:61患者均符合肺结核的临床表现和(或)影像学等特点,进展期24例.好转期16例,稳定期21例,血清腺苷脱氨酶水平检测结果显示进展期和好转期患者血清腺苷脱氨酶水平较稳定期及对照组高(P<0.01),且进展期血清腺苷脱氨酶水平高于好转期((P<0.05),稳定期与对照组比较,血清腺苷脱氨酶水平统计无显著差异(P>0.05).结论:影像学检查是肺结核诊断的基本手段;血清腺苷脱氨酶检测可考虑作为肺结核的辅助诊断之一.     

小鼠腺苷脱氨酶mRNA特异Ribozyme计算机设计

小鼠腺苷脱氨酶mRNA经计算机分析,包括:ribozyme切点位置选择,二级结构预测,基因生物学功能和基因同源性分析,筛选出四个锤头结构ribozyme.结果表明上述ribozyme底物切点两翼碱基形成发夹结构,切点位于单链环区,切点所在基因片段位于该基因生物功能区内,并同已知小鼠其它基因不同源.     

毕赤酵母胞嘧啶碱基编辑器的设计与功能评价

【目的】在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中建立一套分子靶向突变系统,为毕赤酵母的基因工程改造提供高效的编辑工具。【方法】基于规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9）技术,设计并构建nCas9与胞苷脱氨酶融合表达的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor,CBE）,并选择酵母基因组中富含碱基C的一段序列作为靶标以评价CBE的碱基编辑功能。电转化酵母后,利用高通量测序技术分析CBE的编辑效率及编辑模式,并进一步探究连接肽长度、融合蛋白相对位置和gRNA靶向序列（即spacer）长度等因素对CBE功能的影响。【结果】nCas9与PmCDA1融合组成的CBE能够实现毕赤酵母基因组碱基C的高效编辑。当连接肽长度为（GGGGS）₁₀时,CBE的编辑效率最高,编辑窗口位于前间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif,PAM）远端的C20–C14之间,其中C18的编辑效率可达85.1%。nCas9与PmCDA1相对位置的改变对CBE的编辑效率和编辑模式的影响不大。而gRNA靶向序列长度影响着CBE的编辑效率,且gRNA靶向序列长度不能低于17 nt,但19–23 nt之间均可引导CBE对基因组的高效编辑。【结论】本研究在巴斯德毕赤酵母中构建了一套具有高效碱基编辑活性的胞嘧啶碱基编辑器,为基于毕赤酵母的基础和应用研究提供了工具支持。