建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除TSPAN4基因的非小细胞肺癌细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除TSPAN4基因,构建TSPAN4基因稳定敲除的非小细胞肺癌A549细胞株,并检测其对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,为后期探讨迁移体在非小细胞肺癌转移过程中的作用提供实验基础。以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(px459)为载体,与设计好的引物连接后得到敲除载体px459-sgRNA-TSPAN4。以jetPRIME?为转染试剂,将构建好的质粒转染至A549细胞系,嘌呤霉素筛选单克隆细胞株并使用Western blot实验鉴定A549细胞系中TSPAN4基因的敲除效果,细胞划痕实验和Transwell实验检测敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响。该研究成功构建了TSPAN4基因编辑质粒px459-sgRNA-TSPAN4。Western blot结果显示敲除TSPAN4基因能够显著降低A549细胞株中TSPAN4蛋白表达量;敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响在统计学上无显著性差异,降低了N-cadherin的表达,对E-cadherin表达的影响不大。以上研究表明,使用CRISPR/Cas9...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株

CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1(myeloid ectropic viral integration site 1)是TALE(three amino acid loop extension)同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。     

基于AAVS1位点构建稳定表达Cas9蛋白的非小细胞肺癌细胞系

该研究旨在利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术将Cas9基因序列整合入非小细胞肺癌A549细胞基因组中的AAVS1位点,建立稳定表达Cas9蛋白的A549单克隆细胞系。该技术避免了Cas9基因随机整合进入基因组带来的潜在风险。通过PCR、Western blot、CCK-8、STR技术分别检测A549单克隆细胞系的插入位点、Cas9蛋白水平、细胞增殖能力、基因编辑能力以及细胞身份信息。上述结果显示,在单克隆细胞系A549 Cas9-copGFP-1中Cas9基因准确插入至AAVS1安全位点并高表达Cas9蛋白,细胞增殖能力未发生改变。此外,该细胞还具有良好的基因编辑能力,细胞身份信息准确无误。总之, A549 Cas9-copGFP-1细胞可用于进一步的基因编辑,为肺癌相关基因的高通量筛选和功能性研究提供一种有力工具。     

CRISPR/Cas9介导的USP30基因敲除细胞系的建立及其对塞内卡病毒增殖的影响

【目的】利用规律成簇的间隔短回文重复序列/Cas9核酸酶（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease,CRISPR/Cas9）技术建立USP30基因敲除的人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293T cells,HEK-293T）细胞系,为开展宿主泛素特异性蛋白酶30（ubiquitin-specific protease 30,USP30）蛋白的功能研究建立了细胞模型;同时,初步探究USP30蛋白在病毒感染过程中的作用。【方法】根据Ensemble数据库查询USP30基因序列,定位USP30在基因组中不同转录本重叠区的第一个外显子段,设计并合成2对引导RNA （single guide RNAs,sgRNA）,分别构建在pX459载体中;将pX459-USP30-sgRNA质粒转染HEK-293T细胞,并用嘌呤霉素处理,筛选出转染阳性的细胞,然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blotting及测序检测USP30基因的敲除。通过Western blotting及实时荧光定量PCR分析比较塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）在野生型和USP30基因敲除HEK-293T细胞中的复制差异。【结果】Western blotting及测序证实USP30基因敲除单克隆细胞系构建成功。进一步实验发现,SVA在USP30基因敲除细胞中的复制水平显著低于野生型细胞。【结论】成功构建USP30基因敲除的HEK-293T细胞系,首次证明USP30对SVA的复制具有促进作用,为进一步揭示USP30相关免疫反应和SVA感染过程的作用机制提供了良好的细胞模型,也为开展宿主USP30蛋白调控病毒复制的机制研究提供了关键工具和一定的理论依据。     

CRISPR/Cas9技术介导的稳定沉默LDHA表达对肺癌A549细胞增殖的影响

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建稳定沉默乳酸脱氢酶A(LDHA)的A549细胞系,并探讨LDHA沉默对细胞增殖能力的影响。方法:构建特异性靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA,转染A549细胞后经嘌呤霉素筛选获得LDHA沉默的稳定细胞株,并用定量PCR和免疫印迹实验分别检测LDHA m RNA和蛋白的沉默效率。利用MTT法检测A549细胞的增殖情况。结果:测序结果证实,CRISPR/Cas9系统重组载体p X260-LDHA构建成功;筛选出LDHA沉默A549细胞株,定量PCR和免疫印迹实验证实LDHA m RNA和蛋白的表达量均明显下调。MTT法证实:培养24,48,72h后,LDHA沉默A549细胞与对照细胞相比,其增殖被抑制。结论:转染靶向LDHA基因的CRISPR/Cas9系统重组载体,可明显下调LDHA m RNA和蛋白表达,抑制肺癌细胞A549的增殖。     

利用CRISPR/Cas9技术构建AEG-1基因敲除U251细胞系并探讨其转移行为的特点

星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%; Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1肝癌细胞系的构建及对增殖的影响

运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立SAMHD1基因敲除的Huh7细胞系,并检测敲除SAMHD1基因后对人肝癌细胞Huh7细胞增殖的影响.针对SAMHD1基因作用的功能区域,设计靶向SAMHD1的小向导sgRNA(Small Guide RNA).构建lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA重组质粒转化后测序.筛选稳定敲除SAMHD1的稳定细胞系并测序鉴定.采用克隆形成实验分析基因SAMHD1敲除后肝癌细胞Huh7细胞的增殖能力.测序结果显示lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA载体构建成功.Western blot结果和测序结果表明成功构建敲除SAMHD1的Huh7稳定细胞系.克隆形成实验结果表明,相对于Huh7-WT细胞,Huh7-KO SA-MHD1的细胞增殖能力增强(P＜0.01).成功构建基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1基因的Huh7细胞系,SAMHD1的表达缺失促进肝癌细胞的增殖.     

自噬相关基因Atg3在埃博拉病毒组装过程中的作用研究

自噬是真核细胞清除胞内冗余物质的降解机制,也是细胞针对病原体入侵的一种天然免疫机制。自噬相关基因3(Autophagy-related gene 3,Atg3)在细胞自噬发生过程中起决定性作用。为研究Atg3对埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)组装的影响,本研究首先根据CRISPR/Cas9技术构建了携带有Atg3基因靶向向导RNA(guide RNA,gRNA)、表达Cas9的重组质粒pSpCas-Atg3,将此质粒转染至人胚胎肾细胞293T中,之后采用流式分选结合有限稀释法筛选单细胞克隆。细胞基因测序及Western Blot试验表明成功获得了Atg3基因敲除的细胞系。在Agt3基因敲除细胞系和野生型细胞中分别共同转染表达EBOV囊膜蛋白(Glycoprotein,GP)和基质蛋白的重组质粒,包装病毒样颗粒(Virus-like particles,VLP);同时在两种细胞中组装整合有EBOV的重组HIV假病毒,获得的假病毒感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),通过测定报告基因的活性判定病毒对细胞的侵入能力。结果显示Atg3基因缺失后,VLP所整合的GP蛋白显著增多,假病毒对细胞的侵染能力也明显增强(P0.001),表明Agt3能够负调控EBOV的组装和入侵。本研究为开发新抗病毒药物提供了新思路。     

基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。     

CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。     

靶向剪切AAVS1位点CRISPR/Cas9腺病毒系统的构建

本研究拟使用腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统靶向剪切AAVS1位点,为实现AAVS1位点基因定点插入奠定基础。设计针对AAVS1位点的gRNA序列,连接到pENTRY-U6-h EF1a-Cas9载体,通过Gateway技术重组到腺病毒骨架质粒pAD,转染293A细胞包装腺病毒。腺病毒感染Hela细胞系,使用T7E1酶切及测序检测AAVS1位点的打靶效率。T7EI酶切结果显示腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统剪切效率达到28.5%。腺病毒介导的CRISPR/Cas9系统对AAVS1位点成功实施了剪切,为下一步在Hela细胞内进行基因定点敲入及基因治疗奠定了基础。     

NPAS2基因敲除的HepG2细胞系构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建生物节律基因NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系,并初步探讨NPAS2基因敲除对肝癌细胞凋亡的影响。方法:利用sgRNA在线设计工具,针对NPAS2设计两条sgRNA;利用PX459质粒构建分别含有两条sgRNA的敲除载体PX459-sgRNA1;PX459-sgRNA2;利用T7核酸内切酶I检测两条sgRNA活性;将活性较高的打靶载体瞬时转染HepG2细胞,经过药物筛选,克隆化培养及基因测序后得到NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系;利用Western blot检测NPAS2蛋白的表达和凋亡相关蛋白Caspase3的活化;利用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平。结果:成功构建了针对NPAS2的打靶载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体;经过药物筛选和克隆化培养得到的NPAS2敲除肝癌细胞系未检测到NPAS2蛋白的表达;进一步发现NPAS2敲除的肝癌细胞Caspase3明显活化,凋亡水平显著升高。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了NPAS2基因敲除的HepG2肝癌细胞系,并发现NPAS2敲除可以促进肝癌细胞凋亡,为进一步研究生物节律基因NPAS2及其它相关基因在肝癌发生发展中的作用机制提供了有力的工具。     

CRISPR/Cas9系统介导敲除CSN2基因奶山羊胎儿成纤维突变细胞的制备

旨在研究β-酪蛋白(β-casein,CSN2)对奶山羊泌乳性能的影响,利用CRISPR/Cas9系统敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)CSN2基因,为转基因动物模型构建提供核供体。针对CSN2第二号、八号外显子设计5个靶向CSN2基因sg RNA(T1、T2、T3、E1和E2),与PX330-e GFP载体连接,构建PX330-e GFP-sg RNA敲除表达载体,经T7E I酶切实验评估敲除效率;选择第八号外显子敲除效率最高sg RNA,构建PX330-Neo-sg RNA敲除载体,将PX330-e GFP-sg RNA T及PX330-e GFP-sgRNAE与PX330-Neo-sgRNAE组合转染细胞,经流式分选、G418药筛获得敲除CSN2基因细胞。Western blot测定转染细胞CSN2表达情况。测序结果表明各sgRNA均正确连入PX330表达载体中,T7E 1酶切实验表明sg RNA T1、sgRNAE2敲除效率最高达34.9%和25.9%;经荧光定量PCR及免疫荧光检测结果表明,eGFP+Neo转染组CSN2敲除细胞比例显著高于e GFP+e GFP转染组(P0.05)。综上表明,CRISPR/Cas9系统可有效应用于奶山羊胎儿成纤维细胞基因编辑,产生的突变细胞为制备CSN2基因敲除奶山羊提供核供体材料。     

应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。