apoaequorin-egfp融合基因对烟草的遗传转化及其分子检测

用钙离子报告基因非侵入式监测细胞内源钙离子实时变化是目前比较常用的钙离子监测方法。而基于传统荧光共振能量转移原理(FRET)的荧光探针具有较高的量子产率,则是目前应用于细胞或亚细胞水平钙离子检测的重要备选实验方案之一。然而,供体荧光基团的激发过程却经常给最终成像过程带来强的背景和荧光信号光漂白等干扰。水母发光蛋白(Aequorin)能够在底物存在的情况下和3个Ca~(2+)结合,通过氧化还原反应产生一个波长为469 nm的蓝光光量子,借助这一反应中蓝光光量子的产率与细胞中游离Ca~(2+)浓度间存在精确定量关系,研究者可以准确测量细胞内的钙离子浓度动态变化情况。但是由于蓝光的波长短,存在易于被散射而难于被检测等问题,造成了目前直接使用水母发光蛋白检测细胞内Ca~(2+)动态时,实验效率较低。为了解决上述这些问题,我们构建了一种将apoaequorin-egfp基因融合表达的植物双元表达载体,然后通过农杆菌介导的遗传转化法将这个融合基因整合到烟草的基因组中,建立了一个基于生物发光共振能量转移技术(BRET)技术,较为高效的植物细胞内源钙离子动态检测系统。     

植物生长素通过ABP1促进细胞膜泡的外排运输

为了研究植物生长素结合蛋白ABP1(auxin binding protein 1)对膜泡运输的调控,将烟草生长素结合蛋白基因ABP1 cDNA分别构建成可诱导型表达的过表达和干扰表达载体,并将绿色荧光蛋白GFP与烟草分泌载体膜蛋白SCAMP2(secretory carrier membrane protein 2)融合进行细胞的膜泡标记,转化植物模式细胞BY-2后分别获得了转ABP1和antiABP1的两类膜泡标记转基因细胞系。以雌二醇诱导ABP1、antiABP1表达后,结合生长素处理,通过扫描激光共聚焦观察了细胞的膜泡运输变化。当诱导ABP1在细胞内过量表达后,以吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)处理细胞,在细胞核膜及周围内质网膜、细胞质膜以及其他细胞内膜系统都观察到强烈的荧光信号,说明细胞内膜泡运输更为活跃;当诱导antiABP1在细胞内干扰表达时,在细胞核附近维持有较强烈的荧光信号,而细胞质膜及两细胞间隔的荧光信号明显减弱,表明抑制ABP1表达显著抑制了细胞膜泡的外排运输。在ABP1经诱导过表达后,加入IAA处理细胞,在0~6 min时间段内间隔性观察了细胞膜泡对生长素的时间响应,在这段时间内细胞核周围及内膜系统的荧光信号明显增强,细胞质膜的荧光强度没有明显的变化,表明细胞核与内膜系统间存在活跃的膜泡运输,内膜系统向细胞质膜间的外排膜泡运输也逐渐加强。因此,可以证明ABP1参与生长素信号响应,增强细胞膜泡的外排运输。     

构建钙荧光探针细胞用于探究胞浆和线粒体钙对ATP刺激的响应

目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24 h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3～6 s)升至10倍,200 s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5～8 s),并且回落更慢,300 s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。     

动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性方法的建立

目的建立一种动态检测活细胞内泛素-蛋白酶体系统活性的方法。方法将表达绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（DsRed2）的质粒分别改建为表达带有内泛素-蛋白酶体系统降解信号CL1的GFP或DsRed2的pGFP^u或pDsRed2质粒,然后转染HEK293细胞,通过G418筛选得到稳定表达GFP^u或DsRed2^u的细胞系。在蛋白酶体抑制N—Acetyl—Leu-Leu—Norleu—al（ALLN）处理GFP^u或DsRed2^u细胞后,应用免疫印记技术检测细胞内GFP或DsRed,含量的变化,应用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜技术观察GFP或DsRed,荧光强度的变化。结果ALLN处理能使GFP“和DsRed2^u细胞内GFP和DsRed。含量明显增加,荧光强度显著增强,并呈现明显的剂量／时间-效应关系。结论本文成功地建立了检测内泛素-蛋白酶体系统活性的方法,该方法能有效地对活细胞的内泛素-蛋白酶体系统活性进行实时动态检测。     

ROP2参与植物生长素快速响应的膜泡运输调控

ROP2(Rho-related GTPases from plant)为植物中特有的小G蛋白Rho家族的成员,参与植物细胞信号转导过程。为了探讨其在生长素信号响应过程中对细胞膜泡运输的调控作用,构建了拟南芥ROP2过表达(OX-ROP2)、组成激活型表达(CA-rop2)和显性失活型表达(DN-rop2)的载体,分别转化到膜泡标记和生长素结合蛋白ABP1(auxin binding protein 1)调控表达的烟草BY2细胞系,结合生长素处理开展了ROP2对细胞生长素作用下膜泡运输的调控。在生长素IAA作用下,ROP2的过表达和组成激活型表达都能明显促进细胞的膜泡外排运输,而ROP2的显性失活型表达则抑制细胞膜泡外排运输。如果同时诱导细胞中ABP1过表达,能显著增强ROP2对膜泡外排运输的促进作用,而ABP1受干扰抑制表达时,ROP2的过表达及组成型激活表达对膜泡外排的促进作用都受到明显抑制。IAA处理细胞2 min时就可以观察到细胞对IAA信号响应的膜泡运输明显变化,此时细胞核向内膜系统、内膜系统向细胞质膜之间的膜泡外排运输逐渐增强,外排运输的方向趋向于生长素高浓度方向更活跃。该研究说明,植物ROP2参与生长素快速响应的信号转导途径,能促进膜泡朝向生长素浓度较高的一侧外排运输。     

FRET技术在受体信号转导研究中的应用

细胞信号传导是细胞生物学方面的重要内容之一,涉及生命过程的各个方面,包括生长、分化发育、增殖、凋亡、迁移等等,对维持细胞功能及机体生存至关重要。目前对细胞信号转导研究的技术手段多种多样,其中荧光共振能量转移技术（FRET）是研究细胞信号转导较为常用的一种技术,可以实现活细胞内蛋白质之间相互作用的实时检测。本文中我们以受体酪氨酸激酶为例,介绍FRET技术在受体介导细胞信号传导中的应用及进展情况。     

增龄引起复制性衰老细胞胞内钙信号转导的变化

为了观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )引起复制性衰老细胞胞内游离钙的变化以及衰老对其的影响 ,初步阐明衰老引起胞内游离钙变化的机制 .选用人胚肺二倍体成纤维细胞WI 38细胞株 ,利用逆转录PCR(RT PCR)技术及Northern杂交技术检测衰老细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1R)、血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)mRNA水平的表达 ;利用激光共聚焦显微成像技术 (LSCM )观察WI 38细胞在AngⅡ刺激 ,Valsartan阻断条件下细胞内钙离子荧光强度的改变 .AngⅡ通过AT1受体介导增加WI 38细胞内游离钙的水平 ,并随着WI 38细胞传代增加至衰老状态 ,AT2受体高表达 ,AT1受体介导的钙离子信号转导的活性逐渐降低 .提示WI 38细胞衰老过程中钙离子信号的转导活性降低 ,并且AT1R和AT2R在血管紧张素Ⅱ介导的细胞内钙信号活性中具有不同的作用与机制 .为探讨WI 38衰老细胞内钙信号变化机制提供了实验依据     

增强UV-B辐照对小麦幼苗叶肉细胞内Ca2＋水平的研究

以小麦（Triticum aestivum）幼苗叶片为材料,利用提取原生质体方法在小麦幼苗叶肉细胞中成功地装载了钙离子荧光指示剂fluo-3/AM,采用激光共聚焦显微技术检测了增强UV-B辐射后小麦幼苗叶肉细胞内游离钙离子荧光强度的分布,并对[Ca2＋];进行了测定.结果显示,对照组细胞内钙离子荧光分布较均匀,主要分布于紧贴质膜处和核周围,UV-B辐射组钙离子荧光与对照组分布相似,但其原生质体表面不如对照组平滑;同时发现增强UV-B辐射组细胞内钙离子荧光强度值较对照组高,说明增强UV-B辐射组小麦幼苗叶肉细胞维持较高浓度的钙离子水平.这些变化表明Ca2＋信号有可能以一定的方式参与了小麦响应UV-B辐射胁迫的过程.     

脂筏--细胞信号转导发生的平台

在脂筏和胞膜窖中存在有多种参与细胞信号转导的跨膜蛋白质,在细胞内或／和细胞外信号的刺激下。脂筏能改变蛋白质的大小和组成,有助于特异的蛋白质与蛋白质之间的相互作用,从而导致了信号级联反应的激活。脂筏在细胞信号转导事件中的重要作用已越来越受到人们的关注。     

超正电荷绿荧光蛋白+36GFP作为核酸载体的细胞穿透性分析

旨在通过原核表达纯化超正电荷绿色荧光蛋白+36GFP,研究其与核酸的结合作用及作为核酸载体的细胞转导功能。将pET+36GFP-HA2质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,然后表达纯化+36GFP蛋白。将得到的目的蛋白在特定浓度下分别转导293细胞、HepG2细胞、A549细胞和B16细胞,流式细胞仪检测+36GFP的转导效率;+36GFP蛋白(100 nmol/L)转导A549细胞,激光共聚焦显微镜观察结果;将+36GFP蛋白与质粒DNA按不同比例孵育,凝胶阻滞实验检测+36GFP与DNA的结合能力;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测+36GFP蛋白携带质粒DNA转导细胞后报告基因的表达。结果显示,+36GFP蛋白具有较高的细胞转导效率,且随浓度升高转导效率增加,呈浓度依赖性。凝胶阻滞实验显示,+36GFP能够与质粒DNA结合,阻滞DNA在凝胶中迁移,且呈现一定的浓度依赖性。+36GFP包裹质粒转导细胞后,可高效携带质粒DNA转导进入细胞,使质粒报告基因得到表达。本研究成功表达纯化了+36GFP蛋白,证实该蛋白具有较高的细胞转导效率,可将外源核酸携带入细胞使外源基因得到表达。     

绿色荧光蛋白及其应用

绿色荧光蛋白是在水母中发现的新型报告分子,能在多种生物体内表达并发出荧光。对GFP中一些特定氨基酸进行突变可以产生多种类型的突变体,有利于研究蛋白之间或细胞器之间的相互作用。目前,GFP已经用于基因表达的报告、细胞动态的研究、活细胞内蛋白的定位及westernbloting检测中。GFP美好的应用前景也促进了有关GFP的研究,特别是寻找新的突变体并将之运用到细胞生物学和分子生物学的各个领域。     

植物细胞Ca2+荧光蛋白指示剂研究进展

Ca2+作为第二信使参与了植物生长和发育过程的调控,不同生物和非生物胁迫信号均可诱导胞内Ca2+变化.对Ca2+在信号转导作用中的认识主要来自于细胞内Ca2+浓度测定.水母发光蛋白和基于荧光蛋白的Ca2+荧光指示剂作为检测细胞Ca2+信号的手段是近年发展起来的新方法.本文综述了水母发光蛋白和基于荧光蛋白的Ca2+荧光指示剂的发展、测量原理、优点与不足及其在细胞Ca2+信号转导中的应用研究进展.     

植物体内Ca2+,pH,ROS活体荧光探针成像研究进展

细胞内信号分子Ca2+与活性氧(ROS)以及细胞pH,是参与细胞多种生理和发育过程调节的关键因子。这些信号分子或细胞化学势之所以在如此众多方面起作用,是因为它们在生物体内从细胞到器官水平上、从数秒到数小时一直是在时空动态变化着的。恰到好处的是,荧光素感受器可以稳定地对细胞内Ca2+,pH与活性氧(ROS)活体原位实时定量。可视化的荧光细胞探针可分为两类:(a)直接染色;(b)基于绿色荧光蛋由基因编码的感受器。绿色荧光蛋白探针可在亚细胞水平上对目标蛋白准确定位,为得到细胞信号高分辨图提供可能。     

绿色荧光蛋白作为分子标记物在微生物学中的应用

荧光染料在微生物学中的应用受到广泛的关注。近年来 ,来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。其中绿色荧光蛋白 (Greenfluorescentprotein ,GFP ,来源于水母 )具有独特的应用价值。在活体研究中 ,GFP相对于其它报告蛋白 (如 β 半乳糖苷酶 )在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性。对GFP作为分子标记物在微生物学中的应用进行回顾 ,对GFP在微生物与宿主相互作用、生物膜(biofilm)、生物降解、细菌与原生动物相互作用、基因转导、基因表达、蛋白质定位以及生物传感器等领域的应用进行讨论 ,并扼要介绍了一些应用于荧光观察和定量分析的方法。     

应用重组表达钙离子敏感蛋白YC2.1研究粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布

把重组表达钙离子敏感蛋白的YC2．1基因（yellow cameleon 2．1）导入了粟酒裂殖酵母中,观察了粟酒裂殖酵母细胞内钙离子浓度的分布。结果发现,钙离子敏感蛋白所指示的钙离子呈细胞周缘胞质较高浓度分布,而在细胞胞质中部的钙离子浓度相对低一些。通过DAPI染色实验证实这是由于胞质中部细胞核的填充而形成。fluo-3染色的裂殖酵母细胞,由于fluo-3进入到细胞器（房室化现象）,所以出现胞质的内部区域高的荧光信号,而在周缘的胞质区相对弱,不能真实反应胞质钙离子的分布。因此重组表达钙离子敏感蛋白测定钙离子的方法优于fluo-3荧光探针的方法,对于裂殖酵母细胞胞内钙离子的研究具有良好的应用前景。     

PrPc介导的细胞信号转导

朊病毒病的发生是由于细胞正常朊蛋白PrPc转变成了异常构象的PrPc形式。PrPc的生理学功能目前尚不完全明确,可能与铜离子代谢、脂质摄取以及细胞信号传递有关。PrPc可以与小窝蛋白相互作用而活化Fyn非受体酪氨酸激酶从而引起下游信号通路的转导;可以作为受体与PrPc键合多肽结合后激活cAMP／PKA信号通路;以及引起细胞内钙离子浓度变化而活化信号通路。     

重组水母发光蛋白及其在植物钙离子信号检测中的应用

重组水母发光蛋白作为检测植物细胞钙信号的手段是近十几年发展起来的新方法,该文介绍了重组水母发光蛋白作为Ca2+检测探针的发展过程、测钙原理、Ca2+浓度检测方法、Ca2+浓度换算方法、优点与不足、及在植物细胞钙离子信号检测中的研究进展。并利用国外实验室提供的方法在国内首次得出冷激条件下植物细胞内细胞质中([Ca2+]cyt)和液泡膜附近([Ca2+]md)钙离子浓度动力学变化曲线。     

Pyk2介导的细胞信号通路

酪氨酸蛋白激酶在细胞信号传递过程中起重要作用,由酪氨酸蛋白磷酸酶和酪氨酸蛋白激酶协同控制的酪氨酸的磷酸化是细胞生长、分化、凋亡、黏附和迁移等生理过程的重要调节机制。酪氨酸蛋白激酶Pyk2是黏着斑激酶家族成员,能被包括整合素在内的多种细胞外信号激活,参与多条信号通路的传递,在细胞信号转导过程中发挥重要作用。     

绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物

从多管水母属A equoren v ictu ria 分离出的绿色荧光蛋白(GFP) , 因其特有的生物化学性质及该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光, 使其在现代细胞生物学和分子生物学研究领域的应用具有广阔前景。本文就其研究进展及其应用进行简要综述。     

利用荧光蛋白标记研究稻瘟病菌有性世代的细胞结构

稻瘟病是水稻最重要的病害之一,同时稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是植物病原真菌研究的模式生物。稻瘟病菌是异宗配合的子囊菌,但其有性世代的细胞学过程、形态结构、分子机制以及对病菌变异的贡献研究都较少,也缺乏必要的研究手段。该文利用荧光蛋白标记结合荧光染色的方法对稻瘟病菌有性世代结构进行了标记和显微观察,以期为稻瘟病菌有性生殖过程和机制研究提供方法与借鉴。将绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白m Cherry分别导入两个相对交配型的稻瘟病菌菌株Guy11(MAT1-2)和70-15(MAT1-1),各转化子及野生型按交配型组合对峙培养,观察有性世代结构中的荧光表达情况。结果表明,组蛋白H3启动子、核糖体蛋白RP27启动子和疏水蛋白MPG1启动子均可在稻瘟病菌有性孢子形成过程中高丰度表达。进一步利用这三种启动子和两种荧光蛋白对稻瘟病菌有性孢子的细胞器(细胞核、过氧化物酶体)进行标记和观察,结果表明,融合组蛋白H2B的m Cherry及融合核定位信号(NLS)的GFP均能有效标记子囊孢子细胞的细胞核,荧光集中而明亮;带有过氧化物酶体定位信号1(PTS1)的GFP可以有效地标记子囊孢子中的过氧化物酶体,每个细胞中均有数量不等的过氧化物酶体,表明子囊孢子中需要过氧化物酶体参与生化代谢。该文还利用脂肪染色剂尼罗红、BODIPY和细胞壁染色剂卡氏白结合荧光蛋白标记对子囊和子囊孢子进行组合染色。结果显示,尼罗红、BODIPY、卡氏白染色剂互不干扰,可以与不同颜色的荧光蛋白相互组合,从而更加清晰地标记子囊和子囊孢子的结构、细胞器和储藏物质。