Gadd45a的表达调控与功能

哺乳动物细胞对于遗传毒性的刺激会产生一系列应答,如细胞周期阻滞,DNA修复和细胞凋亡等。Gadd45a在DNA损伤诱导的细胞应答中发挥重要作用。细胞内外环境的多种因素在转录水平、转录后水平、翻译后水平等多个层次对Gadd45a进行精确调节。Gadd45a通过与Cdc2相互作用调控细胞周期G1-M检测点,直接抑制Aurora—A激酶参与中心体稳定性的调节,通过G1-S期调控参与维持基因组的稳定性。Gadd45a参与p38／JNK、MAPK、线粒体介导的凋亡途径和NF—κB介导的生存通路调控。     

Gadd45a在抑制细胞转化和肿瘤恶性进展中的作用

Gadd45a,一个受p53和BRCA1调节的生长阻滞和DNA损伤基因,在抑制细胞转化和肿瘤恶性进展中扮演重要的角色.Gadd45a可以通过抑制细胞生长以及促进DNA损伤修复等间接或者直接方式维持基因组稳定性,从而抑制细胞转化和肿瘤的恶性进展.此外,Gadd45a还可通过对一些信号传导通路的调节,参与肿瘤发生发展的抑制.     

p21WAF1／CIP1基因上游主要转录调控序列区及其相关功能

p21蛋白作为周期依赖性蛋白激酶抑制因子,调节细胞周期的进程,参与细胞生长、增殖、分化、衰老等多种活动,p21/WAF1/CIP1基因上游启动子中含有多个转录调控序列,包括p53,Sp1,Ap2,VDR及RAR,STAT,C/EBPα,β,E2A,MyoD和E2F等转录因子的顺式结合元件,在细胞的生长、分化、凋亡,衰老及疾病的发生发展中,这些转录因子通过与p21上游相应调控区相互作用,调节p21基因的表达。     

Mechanism of p53 downstream effectors p21 and Gadd45 in DNA damage surveillance

Both p21 (WAF1/CIP1) and Gadd45 were activated in a p53-dependent manner in MCF-7 cells after being exposed to ionizing radiation. In order to investigate their roles in DNA damage surveillance, p21~(as)/MCF-7 cells stably transfected by p21 antisense expression plasmid pC-WAF1-AS and Gadd45~(as)/MCF-7 stably transfected by Gadd45 antisense expression plasmid pCMVas45 were established. It was observed that G_1 arrest induced by radiation was significantly reduced in Gadd45~(as)/MCF-7 cells as well as in p21~(as)/MCF-7 cells. Repair of radiation damaged report gene greatly reduced in Gadd45~(as)/MCF-7 and p21~(as)/MCF-7 cells. Apoptosis significantly increased in p21~(as)/MCF-7 after exposure to radiation. These results suggest that both p21 and Gadd45 support cellular survival by taking roles in G_1 arrest and DNA repair, furthermore, p21 protects cells from death by inhibiting apoptosis after exposure to ionizing radiation.     

p53转录活化的p21和Gadd45在细胞DNA损伤监视中的作用

p2 1,Gadd45均是受抑癌基因p5 3转录调控的分子 ,当电离辐射引起细胞DNA损伤时 ,p2 1,Gadd45基因的转录以p5 3依赖的方式增强 .为了深入探讨p2 1,Gadd45在DNA损伤监视中的作用 ,构建了稳定表达p2 1及Gadd45反义RNA的p2 1^as/MCF 7及Gadd45 ^as/MCF 7细胞系 .对辐射引起这些细胞G₁期阻滞、DNA损伤修复和细胞凋亡的发生进行了研究 ,发现Gadd45同p2 1一样 ,当其表达受阻后辐射引起的细胞G₁期阻滞明显减弱 ,宿主细胞对辐射损伤的报告基因的修复减弱 ,还观察到辐射引起的p2 1表达受阻的细胞调亡的增加 ,结果表明p2 1,Gadd45通过参与多种辐射细胞学反应发挥DNA损伤监视作用 .     

miR-181c-5p在颅内动脉瘤中通过靶向PTPN4调节血管平滑肌细胞的机制研究

摘要 目的：探讨miR-181c-5p在颅内动脉瘤血管平滑肌细胞（VSMC）表型调节中的生物学功能及其潜在的调控机制。方法：采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测miR-181c-5p mRNA在颅内动脉瘤（IA）患者血清中的表达水平。 采用药物细胞毒性实验（CCK8）、集落形成、transwell迁移和流式细胞仪检测过表达miR-181c-5p介导的VSMC细胞表型的变化。采用双荧光素酶报告基因检测miR-181c-5p的潜在靶标。结果：IA患者血清中的miR-181c-5p表达水平高于健康体检者（P<0.05）。miR-181c-5p的过表达显着抑制了VSMC增殖、克隆形成和迁移,同时刺激了细胞凋亡（P<0.05）。PTPN4被证实是miR-181c-5p的直接靶标,而miR-181c-5p的过表达导致PTPN4在VSMC中低表达。结论：miR-181c-5p / PTPN4介导的VSMC表型调节可能部分导致IA病变。     

EB病毒感染人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中抑制p16INK4a表达

细胞周期调控紊乱是细胞永生化进程中一个重要的分子事件,本文利用Western blotting和S-P法分别检测p16~(INK4a)、p53、p21~(WAF1/CIP1)和E2F1的蛋白表达,试图从细胞周期调控的角度,探讨EB病毒诱导人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期的分子机制。结果表明,EB病毒通过抑制p16~(INK4a)表达而阻断p16~(INK4a)/Rb途径,上调转录因子E2F1,而对p53、p21~(WAF1/CIP1)表达无明显的影响。结果初步揭示,EB病毒介导的p16~(INK4a)/Rb/E2F1细胞周期调控紊乱参与了人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程,为进一步探讨鼻咽癌发病机制提供了科学依据。     

抑癌基因的负转录调控

抑癌基因在正常细胞中适度表达,抑制细胞永生及转化,其转录下调见于某些肿瘤,而在衰老细胞中常见表达上调或活性增强。抑癌基因INK4a／ARF、p53和p21^Cipl的表达及其负调控与肿瘤及细胞衰老的关系十分密切。     

细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞衰老的影响

为了探讨细胞周期抑制因子p19ARF对人二倍体细胞复制性衰老的影响, 构建了重组p19ARF真核表达载体, 并通过脂质体的介导将p19ARF基因转染到人二倍体成纤维细胞WI-38中过表达, 观察其对WI-38细胞衰老的影响. 结果发现与对照细胞相比, 在p19ARF基因导入后, 细胞中p53和p21的表达水平明显上调, 细胞传代数减少10~12代, 生长速率降低, 细胞周期阻滞于G₁期, 衰老标志物SA-β-gal染色阳性率上升, 线粒体膜电位下降, 细胞形态呈衰老细胞样变化, 这些结果表明p19ARF高表达可促进人二倍体细胞的衰老进程.     

EB病毒感染人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中抑制p16^INK4a表达

细胞周期调控紊乱是细胞永生化进程中一个重要的分子事件,本文利用Western blotting和S-P法分别检测p16^INK4a、p53、p21^WAF1／CIP1和E2F1的蛋白表达,试图从细胞周期调控的角度,探讨EB病毒诱导人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期的分子机制。结果表明,EB病毒通过抑制p16^INK4a表达而阻断p16^INK4a／Rb途径,上调转录因子E2F1,而对p53、p21^WAF1／CIP表达无明显的影响。结果初步揭示,EB病毒介导的p16^INK4a／Rb／E2F1细胞周期调控紊乱参与了人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程,为进一步探讨鼻咽癌发病机制提供了科学依据。     

视黄酸对胃癌细胞周期的调控

视黄酸(RA)能够抑制许多类型癌细胞生长、诱导细胞凋亡和调节细胞周期。本文研究了全反式视黄酸(ATRA)对人胃癌细胞的作用机理。结果表明,ATRA通过诱导细胞滞留在G_0/G_1期而显著抑制胃癌细胞生长,但ATRA不能诱导胃癌细胞凋亡;ATRA调控细胞周期与c-myc、磷酸化Rb水平的下调和p21~(WAF1/CIP1)、p53水平的上调有关,而cyclinD_1和CDK_4水平没有明显变化。在RA抗性细胞中,ATRA不能调节这些基因表达。结果证实,ATRA对胃癌细胞生长抑制与其诱导细胞滞留在G_0/G_1期有关,而与细胞凋亡的诱导无关,许多重要的、与周期相关的分子,包括cmyc、p21~(WAF1/CIP1、p53和Rb等参与细胞周期的调控。     

腺病毒介导的p33ING1b过表达显著促进衰老细胞的DNA损伤修复

p33^ING1b是一个较晚发现的肿瘤抑制基因ING1的主要表达形式,自从被成功克隆以后得到了广泛的研究,已有的研究表明,p33^ING1b参与了细胞的生长抑制、凋亡、染色质重塑、DNA损伤修复、肿瘤抑制和细胞衰老等。但是它在细胞衰老过程中的作用特别是对衰老细胞DNA损伤修复的影响还没有被地阐明,在本研究中,我们首先用2BS细胞构建了细胞衰老模型,通过RT-PCR和Western blot技术证实p33^ING1b在衰老细胞中的表达水平是下调的,然后通过构建和包装包含p33^ING1b基因的腺病毒,将p33^ING1b导入年轻和衰老细胞中并使其过表达,用HCR（host cell reactivation）方法检测年轻细胞和衰老细胞DNA损伤修复能力。我们的实验首次表明,相对于年轻细胞,p33^ING1b的过表达使衰老细胞的DNA的损伤修复能力显著增加,这说明p33^ING1b在衰老细胞中的表达下调与衰老细胞DNA损伤修复能力的下降有关,也进一步证实了p33^ING1b在细胞衰老过程中起着十分重要的作用。     

MnSOD过表达对t-BHP诱导间充质干细胞凋亡的保护作用

通过重组慢病毒系统感染人间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs),建立了能够稳定、高效表达锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的细胞株MnSOD-MSCs．从胎儿肝脏组织克隆MnSOD基因,构建重组慢病毒MnSOD的表达载体,感染MSCs．根据荧光表达进行流式分选,获得能够继续稳定传代的高表达MnSOD基因的MSCs,RT-PCR和Western blot结果证实细胞株中的MnSOD基因稳定高表达．用不同浓度的第三丁基过氧化氢(t-BHP)处理细胞,通过CCK-8法检测细胞的存活率,SA-β-gal染色观察细胞的衰老情况,流式细胞技术分析细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR分析p53和p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)的表达．结果发现,MnSOD过表达可提高细胞的存活率,抑制细胞的凋亡,SA-β-gal染色阳性率降低,且p53和PUMA表达下调．这提示MnSOD过表达对t-BHP诱导的细胞凋亡具有保护作用．     

参与细胞增殖调控的多功能分子p21

p21是近年来发现的一类调控细胞增殖的小分子,是依赖周期素的CDK抑制因子.这些蛋白因子可结合cyclin－CDK并抑制其激酶活性从而调节细胞周期p15、p16、p27均属该类分子,他们在G₁期限制点及G₁／S检查点调控中发挥作用．进一步的研究表明,p21为p53调控,在p53介导的DNA损伤诱发的细胞周期阻断中发挥作用p21在老化细胞中高表达、细胞分化的同时表达,表明其在细胞增殖、分化及老化中发挥调节作用．     

莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞衰老及其机制研究

为进一步探讨莪术醇的诱导细胞衰老的机制,该研究采用荧光定量PCR技术对莪术醇处理后细胞中81个细胞衰老相关基因差异表达谱进行分析,结果发现TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表达水平显著升高,伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多个衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强,而CyclinA2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。Western印迹检测结果显示,p53及其下游周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CKI)分子p21WAF1和p16INK4水平升高,CyclinA2水平降低,与PCR结果一致,并伴野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)水平显著增高,提示莪术醇可能通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞衰老。该研究进一步发现莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变,伴G0/G1期周期阻滞。     

参与细胞衰老的蛋白质结构域

  大多数正常体细胞有有限的复制周期,并最终进入生长停滞状态被称为复制性衰老.迄今比较公认的3条细胞衰老信号转导途径是：p16INK4a/Rb、p19ARF/p53/p21Waf1以及PTEN/p27.目前发现,在基因转录水平上,有些转录因子的结构域对调节p16INK4a、p53/p21Waf1以及p27等与细胞衰老相关基因的表达有重要作用,如E2DBD、环指域(RING finger)等;其次,各条通路要发挥作用,必然要借助其上下游蛋白质的相互作用,其中结构域发挥了纽带作用.本文对其中某些蛋白质相互作用的结构域进行了描述.最后,还总结了其他一些参与细胞衰老的结构域.     

MEF2A基因突变对血管平滑肌细胞增殖迁移及其表型的影响

目的:观察肌细胞增强因子2A(MEF2A)基因突变对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖迁移及其表型的影响。方法:分别将野生型(WT)MEF2A质粒(WT组)、21个核苷酸缺失突变型(△21,显性负突变)MEF2A质粒(△21组)以及MEF2A siRNA(siRNA组)转染进人主动脉血管平滑肌细胞(VSMC),通过溴化噻唑基蓝四唑(MTT)法和Millicell小室观察各组VSMC的增殖和迁移变化,免疫印迹(Western blotting)检测各组VSMC之间MEF2A蛋白、平滑肌α肌动蛋白(α-SM-actin)、SM22α、骨桥蛋白和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路表达差异。结果:MEF2A△21组和MEF2A siRNA组的VSMC增殖增加,迁移数量增多;同时此两组中α-SM-actin和SM22α表达减少,骨桥蛋白表达增加;磷酸化p38和ERK1/2表达也明显增强。结论:MEF2A基因显性负突变及沉默可使VSMC向合成型转化,其增殖和迁移能力增加。而p38和ERK1/2MAPK信号通路可能参与MEF2A基因介导的血管平滑肌细胞表型转化。     

hDaxx的克隆及其与Pin1之间的相互作用

克隆了hDaxx全长的cDNA,并证实hDaxx与肽基脯氨酰异构酶Pin1之间存在相互作用,它们共定位于细胞核内。同时发现它们能够协同激活p53的转录活性,揭示Pin1可能在hDaxx调节细胞凋亡的过程中发挥了重要作用。     

含p53保守结合位点的microRNA表达载体的构建及应用

目的:构建含p53保守结合位点的microRNA(miRNA)表达载体,促进相关miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中的高效表达。方法:改构miRNA表达载体pCMV-miR,在其多克隆位点前插入p53保守结合位点,分别将miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21插入上述改构的载体pCMV/p53-miR,将构建的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞,分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果:转染改构的miRNA表达载体后,HeLa细胞中miR-138、miR-34a和miR-21的表达水平明显提高,它们对应的已知靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN的表达同时被显著下调。结论:在p53转录调控作用下,具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效地提高miRNA的表达水平;构建的载体不但可用于促进相关miRNA的表达,也能用于miRNA是否受p53调控的检测。     

早老素通过下调CDK4使HEK293T细胞周期阻滞

早老素（progerin）的累积导致儿童早老症（Hutchinson Gilford progeria syndrome, HGPS）的发生,并与正常衰老相关。早老素能使细胞内稳态失衡但分子机制仍有待深入研究。本研究旨在探讨早老素导入人胚胎肾293T细胞（human embryo kidney 293T cell, HEK293T）后细胞增殖、周期变化的分子机制。形态学观察发现过表达早老素的HEK293T细胞密度下降,(57±2.47)%细胞核形态皱缩。细胞增殖和周期实验证明早老素使细胞增殖减慢,发生G1/S期阻滞,G1细胞从 (42.3±1.31)%升至(47.2±1.26)%,而S期细胞从 (43.1±1.36)%降至 (38.5±1.42)%。Western印迹结果显示早老素的高表达引起p21蛋白表达上调（103.2±1.49）%,CDK4下调（63±1.52）%,而p53、ATM、CyclinE1以及p16等蛋白质水平均不变;HEK293T细胞中早老素的过表达导致γ H2AX水平下调（53±1.36）%,H2O2处理后变化趋势不变。我们的研究结果提示,早老素通过上调p21和下调CDK4使细胞发生周期阻滞,不能增加HEK293T细胞的损伤及衰老。