利用RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF基因的表达

目的:CTCF是一种多功能的转录因子,参与启动子调控、绝缘子功能和遗传印记等过程。利用RNA干扰技术抑制CTCF在体细胞中的表达。方法:以CTCF为靶基因,利用ShortCutRNaseⅢ切割体外转录的长双链RNA制备esiRNA,转染HeLa细胞,用RTReal-TimePCR检测CTCF的mRNA水平,用免疫印迹检测CTCF水平。结果:转染CTCFesiRNA后,细胞内的CTCFmRNA被抑制了70%左右,CTCF水平明显下降。结论:CTCF的esiRNA可以明显抑制CTCF在HeLa细胞中的表达,从而为进一步研究CTCF的未知功能打下了基础。     

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。     

HBx抑制IGFBP3转录的机制

【目的】在细胞水平上研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)转录的影响并对具体机制进行初步探索。【方法】首先采用RNA-Deep-Sequencing技术分析HepG2和乙型肝炎病毒(HBV)转基因细胞HepG2-4D14中表达差异的基因,然后通过实时定量PCR对相关基因进行验证;利用启动子报告基因分析,研究HBx对相关基因IGFBP3转录的调控;通过染色质免疫共沉淀方法,分析HBx抑制IGFBP3启动子活性的机制。【结果】RNA-Deep-Sequencing的结果表明IGFBP3在HBV转基因细胞HepG2-4D14中水平显著下调,实时定量PCR结果与RNA-Deep-Sequencing一致。进一步研究表明HBx能明显抑制IGFBP3的转录,通过实时定量PCR发现HBx对IGFBP3转录的抑制作用依赖于p53;染色质免疫共沉淀实验结果表明HBx能够通过抑制p53与IGFBP3启动子的结合,从而抑制IGFBP3的转录。IGFBP3是一种细胞周期负调控蛋白,我们推测HBx对IGFBP3水平的下调是其促进细胞增殖的途径之一。【结论】HBV能显著下调IGFBP3的转录,机制研究揭示HBV HBx通过干扰p53与IGFBP3启动子的结合进而抑制IGFBP3的转录。     

串联反向CTCF位点的系列删除揭示增强子调控HOXD基因簇表达的平衡

三维基因组染色质架构蛋白CTCF(CCCTC-bindingfactor)能够介导增强子与基因启动子的远距离染色质相互作用,也可以结合调控区域的绝缘子发挥增强子绝缘功能,对发育中的基因表达调控具有重要作用。同源框基因家族(Homeoboxgenefamily,Hox)编码一类控制动物发育的关键转录因子,在发育中主要沿胚胎首尾轴(head-to-tail axis)呈时空线性表达。在哺乳动物中,Hox基因分为HoxA、HoxB、HoxC和HoxD四个基因簇,在中枢神经系统、骨骼和四肢发育中发挥重要功能。HoxD基因簇主要调控四肢发育,受位于其两侧调控域内的增强子调节,沿肢体近远轴(proximal-distal axis)呈时空线性表达。在人类基因组中,HOXD基因簇及其两侧的调控区域分布有串联排列的CTCF结合位点(简称CTCF位点),参与9个HOXD基因的表达调控。本研究以HOXD基因簇为模式基因,探究CTCF对发育基因(developmentalgenes)转录调控的影响。利用CRISPRDNA片段编辑技术在人HEK293T细胞中获得一系列的串联反向CTCF位点删除的单细胞克隆株。...     

可诱导型CRISPRi系统的构建及其初步应用

[目的]构建可诱导型CRISPRi系统以特异性地抑制靶基因的表达。[方法]采用PCR技术将人ZNF10基因的KRAB结构域编码序列分别克隆至d Cas9蛋白编码基因的5’端(KRAB-d Cas9)与3’端(d Cas9-KRAB)。设计并构建靶向荧光素酶报告基因起始密码子附近序列的4种gRNA表达载体,其表达受到含有Tet O调控元件的H1启动子调控。分析共表达d Cas9蛋白和gRNA对共转染的荧光素酶报告基因表达水平的影响。在此基础上,设计并构建靶向人KLHL21基因转录起始位点附近区域的3种gRNA表达载体,将其与KRAB-d Cas9融合表达载体分别共转染HEK293T细胞,24h后收集细胞并采用荧光实时定量PCR与蛋白质印迹技术分析KLHL21基因表达水平的变化。[结果]CRISPRi系统有效地抑制HEK293T细胞中荧光素酶报告基因与内源性的KLHL21基因的表达。共表达TetR抑制蛋白可阻断CRISPRi对荧光素酶报告基因表达的抑制作用,在细胞培养基中加入1μg/ml盐酸四环素可解除这种抑制作用。[结论]成功构建了可诱导型CRISPRi系统,可有效抑制真核细胞基因的表达。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型CTCF结合位点抑制启动子功能

为了找到CTCF在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)中的结合位点,并探讨其基因表达调控作用。对比HSV-1与HSV-2全基因组中CTCF结合序列区别;生物信息学分析HSV-2全基因组;Jaspar在线预测CTCF结合位点;依据CTCF结合的序列特点预测结合位置;PCR扩增预测位点并插入pGL3-promoter构建重组载体;重组载体转染人胚胎肾细胞(293T)双荧光检测验证预测位点转录调控效应。预测得到三个CTCF结合位点分别位于潜伏相关转录本(LAT)上游(CTUL)、下游(CTa’m)及内含子(CTRL)位置;扩增目的片段并构建重组载体,双酶切及测序验证成功;双荧光检测显示LAT内含子(pGL3-promoter-CTRL)及下游(pGL3-promoter-CTa’m)结合位点重组载体转染组与pGL3-promoter载体转染组相比,荧光强度明显减弱,差异有统计学意(P0.001),但与pGL3-basic组相比,并没有完全沉默荧光霉素的表达;上游结合位点重组载体(pGL3-promoter-CTUL)转染组与pGL3-promoter相比无明显差异(P0.05)。HSV-2LAT序列内含子及下游序列上存在CTCF结合位点,具有减弱基因启动子功能的效应,可能在HSV-2维持潜伏中发挥作用。     

副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

为了探讨副溶血性弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS) VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录,该抑制机制与CalR无关联。     

副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS间接抑制VP1687-1686的启动子区转录

为了探讨副溶血弧菌拟核相关蛋白H-NS对Ⅲ型分泌系统(T3SS) VP1687-1686基因位点的转录调控,本研究提取副溶血弧菌hns突变株(Δhns)和野生株(WT)的总RNA,采用引物延伸实验研究靶基因的转录起始位点,并根据产物的丰度判断H-NS对靶基因的调控关系;采用实时定量RT-PCR研究靶基因mRNA在WT和Δhns中转录丰度,以判定H-NS对靶基因的转录调控关系;将靶基因启动子区域DNA序列克隆至lacZ基因上游,将重组质粒转入WT和Δhns中,得到相应的LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合实验研究H-NS对靶基因的调控关系;用PCR扩增靶基因的启动子区DNA序列,并纯化His-H-NS蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)研究His-H-NS是否对靶基因启动子区具有直接的结合作用。研究结果显示,T3SS的VP1687-1686只含有一个转录起始位点,位于翻译起始位点上游82 bp处,且H-NS能够抑制其转录活性,但不能直接结合到VP1687-1686区的启动子区。另外,H-NS对calR的转录无调控作用,His-H-NS也不能结合到其启动子区。本研究的结果初步说明,H-NS能够间接抑制VP1687-1686的转录,该抑制机制与CalR无关联。     

利用cut&tag技术探究LHX9基因在颗粒细胞的调控机制

摘要 目的：在人卵巢颗粒细胞癌细胞株KGN中探索转录因子LHX9下游主要的靶基因及其调控。方法：首先我们采用实时荧光定量PCR观察KGN细胞在卵泡刺激素（FSH）干预前后性腺分化和性激素合成过程中重要基因的表达情况，同时我们利用cut&tag测序技术在两组细胞中识别LHX9下游靶基因，并采用双荧光素酶报告实验对重要靶基因NR5A1的调控进行了验证。结果：实时荧光定量PCR结果显示，通过加FSH处理12小时后，LHX9和NR5A1基因的mRNA水平表达降低，相反的，StAR和CYP19A1基因的mRNA水平表达增高；通过cut&tag测序技术和生物信息学分析，我们发现LHX9下游基因主要分布在内吞作用、细胞衰老、肿瘤相关通路、细胞周期、凋亡、卵母细胞减数分裂、雌激素信号转导等通路上。LHX9可以转录调控性腺分化以及类固醇激素合成的一些重要基因，其中包括NR5A1和SOX9等，荧光素酶报告基因证实了LHX9可以直接结合NR5A1基因的启动子区。结论：本研究利用cut&tag测序技术，发现转录因子LHX9对性腺分化和性激素合成的关键基因有转录调控作用，对深入理解LHX9基因对生殖系统的作用具有重要意义。     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。     

EN1调节UTROPHIN表达机制

为了探讨人类UTROPHIN蛋白表达上调的可能因素,文章利用P-match软件预测人类UTROPHIN基因启动子区域可能的调控元件,应用CHIP和EMSA实验加以验证,并利用RNA干扰和荧光定量PCR的方法分析人类EN1转录因子调节UTROPHIN表达的作用机制。经P-match软件预测,UTROPHIN基因启动子区域有2个转录因子EN1的可能结合位点,经CHIP和EMSA实验证实位点2是真正结合位点。通过RNA干扰实验,发现在HeLa细胞中EN1基因沉默后,可使UTROPHIN mRNA水平上调。以UTROPHIN蛋白为靶点可能为DMD(Duchenne muscular dystrophy)基因治疗提供一种新的策略。     

果蝇组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3选择性调控形态发生素靶基因转录

在真核细胞中,组蛋白的乙酰化状态对于基因转录的正常进行具有重要的调控作用。组蛋白的乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HATs)执行,这种修饰是动态的、可逆的,负责去乙酰化修饰的酶是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs),推测HDACs可能通过影响组蛋白的乙酰化状态在基因的转录过程中发挥调控作用。该文以组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3为对象,研究了它们在果蝇翅膀发育过程中对Wg(Wingless)、Hh(Hedgehog)以及Dpp(Decapentaplegic)信号通路下游靶基因转录的调控作用。结果发现,HDAC1功能缺失可导致Dpp下游靶基因Omb(optomotor-blind)和Hh下游靶基因Ptc(patched)的表达上调。Real-time quantitative PCR(RT-q PCR)结果显示,在HDAC1基因敲除的果蝇中,Ptc、Ci(cubitus interruptus)以及Omb的转录水平增加。HDAC3缺失导致Sal(spalt)的表达上调。RT-q PCR结果证实了HDAC3基因敲除果蝇的Sal转录增加,同时发现Vg(vestigial)的转录下降。而过表达HDAC1或HDAC3对下游靶基因的表达则没有影响。综上所述,该研究表明,HDAC1和HDAC3可以选择性地调控形态发生素下游靶基因的转录。     

脂肪酸诱导胰岛β细胞凋亡过程中FoxO1对MTP的转录调控研究

目的研究微粒体甘油三酯转移蛋白MTP在脂肪酸诱导的胰岛B细胞凋亡过程中,转录水平受FoxO1调控的情况。方法脂肪酸处理胰岛8细胞系MIN6细胞,MTF和Hoechst染色检测细胞活力和凋亡情况;ReahimePCR检测MTP相对表达量;染色质免疫共沉淀技术检验FoxO1与肘即启动子区的结合情况;荧光素酶报告基因系统检测Fox01对MTP的转录调控情况。结果脂肪酸处理引起MIN6细胞活力下降、凋亡增加,使MIN6细胞中MTP mRNA水平上升;糖尿病模型小鼠胰岛中MTPmRNA水平上升;转录因子FoxO1的过表达可上调MTP的转录活性;ChIP—PCR结果显示FoxO1能与MZP的启动子区相结合。结论MTP在脂肪酸诱导胰岛B细胞凋亡的过程中,作为转录因子FoxO1的下游靶基因,转录水平受到FoxO1的调控。     

单核细胞增生李斯特菌LadR蛋白对外排泵MdrL的调控机制研究

研究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)调控子LadR对外排泵MdrL的调控作用及方式。采用同源重组技术构建ladR基因缺失菌株ΔladR;通过实时荧光定量PCR检测mdrL基因在野生株EGD-e和突变株ΔladR中的转录水平;构建重组蛋白表达菌株BL21(DE3)-ladR并纯化重组蛋白His6-LadR;通过凝胶阻滞试验检测LadR蛋白与mdrL基因启动子区域的结合活性。成功构建ladR基因缺失菌株ΔladR。与野生株EGD-e相比,突变株ΔladR中mdrL基因的转录水平提高约51倍;成功构建重组蛋白表达菌株BL21(DE3)-ladR,纯化得到浓度为1 mg/mL的重组蛋白His6-LadR;凝胶阻滞实验结果显示,重组蛋白His6-LadR可与mdrL基因的启动子区域特异性结合。Lm的调控子LadR通过与mdrL基因启动子区域特异性结合实现对外排泵MdrL的负调控。     

干扰PML对人髓系白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响及机制探讨

早幼粒白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因与维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)基因形成PML-RARα融合基因是急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)发生的分子基础,而PML在除APL外的其他髓系白血病亚型中的作用研究少见报道。为探讨PML在非APL的髓系白血病恶性表型中的调控作用及潜在机制,该文首先通过q PCR和Western blot检测了5株非APL来源的髓系白血病细胞中PML的表达水平。接着将靶向PML基因的sh RNA慢病毒(sh PML group)感染高表达PML的THP-1细胞;同时,设立未处理对照组(Mock group)和阴性对照组(Scramble group),嘌呤霉素筛选稳定表达sh PML的细胞株。q PCR和Western blot检测sh RNA干扰效率;CCK-8检测细胞体外增殖活性,克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白质Bcl-2、Bax水平和AKT及下游靶分子Foxo3a磷酸化蛋白质水平的改变。结果显示,5株髓系白血病细胞中PML m RNA和蛋白质水平不同,其中以THP-1细胞中的PML表达水平较高。靶向PML基因的sh RNA慢病毒感染THP-1细胞后,PML m RNA和蛋白质水平均明显下降,提示成功构建稳定表达sh PML的THP-1细胞株。与Mock组和Scramble组相比,sh PML组的细胞增殖能力显著增强(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.05);同时,抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高、促凋亡蛋白Bax水平降低;此外,干扰PML表达可增加p AKT(S473)及下游靶分子p Foxo3a(S253)的蛋白质水平,而总AKT和Foxo3a的蛋白质水平未见明显变化。该研究的结果提示,PML基因可能通过调控AKT/Foxo3a信号通路活性抑制白血病的恶性表型,表明PML在不同白血病型别中发挥着不同的作用。     

小鼠M1细胞中ctcf基因的敲降及其对c-myb基因表达的影响

c-Myb转录因子能够调控造血细胞的分化和增殖,其转录调控受到多种机制影响。本实验室前期研究发现在小鼠急性髓系白血病M1 (Mouse myeloid leukemia)细胞中CTCF结合在c-myb基因上游调控区域,但是具体机制仍然不清楚。为了探索CTCF对c-myb基因转录调控的影响,本研究设计了针对小鼠ctcf基因的shRNA (Small hairpin RNA)干扰序列,并将其连接到载体pLKO.1中,得到ctcf-shRNA慢病毒干扰载体,测序验证后,与慢病毒包装质粒pCMV-DR8.91、pCMV-VSVG共转染至HEK293T细胞中,经HEK293T细胞包装病毒感染小鼠M1细胞,通过RT-qPCR和Western blotting实验分别检测ctcf基因被干扰后,c-myb基因在mRNA水平和蛋白水平的表达变化。RT-qPCR实验结果表明,含有ctcf-shRNA序列的慢病毒感染M1细胞后,ctcf基因mRNA表达量与对照组相比明显下降,同时检测到ctcf基因被敲降之后,c-myb基因的mRNA表达随之降低,Western blotting实验结果表明,当ctcf基因的表达被干扰之后,c-Myb蛋白的表达也明显下降。本研究发现c-myb基因的表达受到CTCF的调控,为进一步研究c-myb基因的表达调控机制提供实验依据。     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域     

人肠组织特异抗原A33基因5′调控区的克隆及其功能分析

用基因组步行法 (genomewalker)克隆了人A33抗原基因的 5′调控区 94 0bp片段 ,并用PCR法鉴定了这一克隆的正确性 .将该序列提交GenBank ,登录号为AF2 0 0 6 2 6 .用引物延伸法 (primerex tension)确定了A33基因的转录起始位点 ,发现该位点位于一个TATA盒下游 10个碱基处 .以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建了不同长度的A33启动子 5′缺失载体 ,用脂质体介导的方法将这些载体转染LoVo、HeLa、2 93等细胞 ,比较了EGFP的表达水平 .研究发现 ,A33启动子上主要转录调控元件以及与组织特异性表达相关的转录调控元件位于A33启动子的 - 10 4～ + 2 5bp区域     

肺炎克雷伯菌RcsAB蛋白对荚膜多糖相关基因wcaJ、wcaG和magA的调控关系

荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯菌(Klebssiella pneumoniae)重要的毒力因子.Rcs系统是肠杆菌科(En-terobacteriacese)中重要的双组分信号转导系统,RcsAB是其中主要的转录调控蛋白.本研究选取了肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 cps基因簇上的3个基因(wcaJ,wcaG和magA),研究RcsAB对上述3个基因可能存在的调控关系.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和LacZ报告基因融合试验来确认RcsAB是否能够调控上述3个基因的转录表达.进而用凝胶阻滞试验(EMSA)验证RcsAB能否直接结合在靶基因的启动子区,对靶基因进行直接调控.结果表明RcsAB能够正向调控上述3个基因的转录表达,EMSA的结果提示RcsAB对这3个基因可能是通过间接的方式进行调控.RcsAB蛋白可能通过间接调控荚膜多糖基因wcaJ、wcaG和magA的转录,从而影响菌株的荚膜多糖表型.     

肺炎克雷伯菌RcsAB蛋白对荚膜多糖相关基因wcaJ、wcaG和magA的调控关系

荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯菌(Klebssiella pneumoniae)重要的毒力因子.Rcs系统是肠杆菌科(En-terobacteriacese)中重要的双组分信号转导系统,RcsAB是其中主要的转录调控蛋白.本研究选取了肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 cps基因簇上的3个基因(wcaJ,wcaG和magA),研究RcsAB对上述3个基因可能存在的调控关系.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和LacZ报告基因融合试验来确认RcsAB是否能够调控上述3个基因的转录表达.进而用凝胶阻滞试验(EMSA)验证RcsAB能否直接结合在靶基因的启动子区,对靶基因进行直接调控.结果表明RcsAB能够正向调控上述3个基因的转录表达,EMSA的结果提示RcsAB对这3个基因可能是通过间接的方式进行调控.RcsAB蛋白可能通过间接调控荚膜多糖基因wcaJ、wcaG和magA的转录,从而影响菌株的荚膜多糖表型.