垂体瘤转化基因1(PTTG1)的表达变化对人前列腺癌细胞LNCaP生长增殖的影响

垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)具有促进肿瘤生长和转移的作用.通过上调或下调基因表达的策略,观察PTTG1基因对人前列腺癌细胞株LNCaP细胞生长增殖的影响.利用PCR技术分离出PTTG1全长cDNA,分别正向和反向插入真核表达载体pIRES2-EGFP,重组载体分别命名为正义PTTG1-S/pIRES2-EGFP(即pI-P-S)和反义PTTG1-AS/pIRES2-EGFP(即pI-P-AS),将这两种重组载体稳定转染LNCaP细胞,通过流式细胞仪和MTT法分别检测了细胞周期和细胞增殖的情况.转染正义PTTG1后处于S期和G2期的细胞明显增加,细胞生长增殖能力增强;相反,转染反义PTTG1后处于S期和G2期细胞明显减少,细胞生长增殖能力减弱(P<0.05).结果表明,PTTG1能明显改变人前列腺癌细胞株LNCaP的细胞周期和细胞生长增殖能力,它的异常表达可能参与前列腺癌细胞生长增殖过程.     

垂体瘤转化基因(PTTG1)可抵抗UV诱导的细胞凋亡作用

垂体瘤转化基因（PTTG1）在很多肿瘤中呈高水平表达.越来越多的研究表明,PTTG1与细胞增殖、细胞转化有关.但PTTG1在凋亡中的作用仍不清楚.通过在细胞中下调和过表达PTTG1,观察PTTG1在UV照射诱导凋亡中的作用.结果发现, RNAi-介导下调HeLa细胞PTTG1表达可增加对UV诱导凋亡的敏感性,而过表达PTTG1则降低对UV诱导凋亡的敏感性.此外,UV照射能降低PTTG1蛋白的表达水平,并且表现为明显的剂量和时间关系.这些研究结果显示,PTTG1在UV照射诱导的凋亡中发挥重要的抗凋亡作用.这为研究PTTG1在肿瘤发生、发展中的作用机制提供了新的实验证据.     

光裸星虫Cdc25基因的克隆及在卵母细胞中的表达分析

细胞分裂周期蛋白25(cell division cycle 25,Cdc25)是一种重要的双特异性磷酸酶,对卵母细胞减数分裂进程和胚胎发育具有重要的调控作用.本研究利用RACE技术克隆获得了光裸星虫(Sipunculus nudus)Cdc25(Sn-Cdc25)cDNA 全长.Sn-Cdc25全长为4 130 bp,其中3'UTR 为 1 849 bp,5'UTR 为427 bp,开放阅读框为1 854 bp,编码617个氨基酸.序列分析显示,Sn-Cdc25蛋白分子量为69.58kD,具有M相诱导磷酸酶结构域(M-phase inducer phosphatase domain)和硫氰酸酶同源结构域(rhodanese-like domain)两个典型的Cdc25蛋白结构域,以及能催化去磷酸化过程的活性位点序列HCX5R.多序列比对发现Cdc25同源蛋白的C端同源性较N端的高.三级结构预测表明Cdc25同源蛋白及其活性位点的三级结构构象高度相似.motif分析中共发现5个motifs,其中motif 1和motif 2分别为Paxillin LD基序和MYND结构域结合基序.系统进化树分析显示,无脊椎动物和脊椎动物的Cdc25分别聚为两大支.RT-qPCR结果显示,在不同发育时期卵母细胞中,Sni-Cdc25的表达差异显著,具有两个峰值,从卵黄形成初期至卵黄旺盛合成后期(O1～O3)Sn-Cdc25表达量上升可能与Cdc25促进DNA的复制过程相关;而从体腔液中进入到肾管后(O4～O5),表达量的迅速上升可能有利于成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的活化.研究结果为深入认识星虫动物卵母细胞发育调控机制和优化人工繁育技术积累基础资料.     

Gas6在猪卵母细胞及早期胚胎中表达模式与功能的初步研究

该研究通过免疫组化和QRT-PCR等方法系统分析了Gas6（growth arrest-special gene 6）基因在猪卵泡发生及早期胚胎发育过程中的表达规律,并提出了一种改良猪卵母细胞体外成熟系统的方法。研究结果显示,Gas6基因表达于猪卵巢中的卵母细胞细胞核及其周围的卵丘细胞,在卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育过程中始终有表达,且在囊胚中表达最高。Gas6 mRNA在卵母细胞成熟过程中始终存在,但在孤雌激活后迅速消失,直到发育到囊胚时再次出现。在猪卵母细胞体外培养系统中添加不同浓度的Gas6重组蛋白培养卵母细胞,发现添加Gas6重组蛋白对卵母细胞的极体率无显著影响;但是当添加浓度为100 ng/mL时,培养的卵母细胞孤雌激活后分裂率、囊胚率及囊胚细胞数都显著增高。Gas6可能是通过改善卵母细胞细胞质的成熟质量提高卵母细胞的发育潜能,从而获得了更多、更好的胚胎。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达

猪圆环病毒(porcinecircovirus ,PCV)属圆环病毒科(Circoviridae) ,为单股负链DNA病毒,以滚环方式进行复制,是目前已知的最小的动物病毒之一.PCV有2种基因型即PCV 1和PCV 2 ,两者细胞培养均不引起病变.前者广泛存在于猪源肾细胞中,但并不引起感染猪发病,其基因组为1 75 9bp ;后者首先由Allan等[1 ] 从患断奶猪多系统衰弱综合症(postweaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)的猪群中分离到,被证明为PMWS的重要病原.PCV 2主要侵害感染猪的免疫系统[2 ] ,从而诱发猪体的免疫抑制.PCV 2常和呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)…     

大熊猫垂体泌乳素(PRL)cDNA的克隆与表达

从大熊猫脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR技术,首次扩增出大熊猫垂体泌乳素(PRL)cDNA序列(GenBank登录号：AY161285)。结果表明,大熊猫PRL cDNA的开放阅读框为687bp,编码含229个氨基酸残基的前体蛋白。将克隆的PRL cDNA片段构建到表达质粒pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导下表达PRL蛋白。SDS—PAGE电泳结果表明,表达的PRL蛋白为不可溶蛋白。蛋白质同源性比较显示,大熊猫与猪、猫的同源性大于95％,与人、牛、山羊的在70％～80％之间,与小鼠、大鼠的分别为45．9％和52％。大熊猫aa^64为丝氨酸,是亲水性氨基酸;而猫、牛、山羊(脯氨酸)和人(丙氨酸)aa^64是疏水性氨基酸。在二级结构上,aa^64在第一α螺旋与第二α螺旋之间,极性的差别可能导致蛋白空间结构的不同。     

猪Ghrelin与IGF-1融合基因克隆和表达研究

目的本试验克隆和构建了猪Ghrelin(GL)与类胰岛素生长因子-1(IGF-1)的融合基因及其表达载体,研究它们在体外HEK293细胞的表达,为探索新型高效的动物生长和免疫调节生物制剂奠定了基础。方法利用基因重叠延伸PCR技术分别获得了GL、短链IGF-1基因及其融合基因(GI),双酶切后插入到VR1020真核分泌型表达载体上,分别命名为VGL、VRI和VGI。用壳聚糖(Chitosan,CS)和mPEG-PEI-CS分子包裹VRI、VGH和VGI制备纳米颗粒,先后进行HEK293细胞转染表达实验。结果成功克隆了猪Ghrelin基因及其与IGF-1的融合基因,构建了它们的真核表达载体,并进行了纳米分子包装,在HEK293细胞获得高效表达。结论猪Ghrelin和IGF-1融合基因及其真核载体的成功构建和表达,为进一步研发安全有效的新型生物制剂、促进动物的生长发育和免疫机能提供了新途径。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

猪精氨酸-丝氨酸蛋白激酸3(SRPK3)基因的克隆、表达及多态性分析

通过对猪SRPK3基因初步的研究,为猪分子遗传育种提供基础分子生物学信息,为猪的遗传育种提供分子标记。以大白猪为实验材料,采用RT-PCR方法克隆了精氨酸-丝氨酸蛋白激酶3 (serine/arginine-rich specific kinase 3,SRPK3) 的全长基因CDS区;采用生物信息学方法分析了SRPK3基因核酸序列并对其所编码的的蛋白序列进行了预测与分析编码蛋白序列的结构特点;采用PCR-SSCP方法对大白猪,野猪,民猪及野家杂交猪的SRPK3基因的多态性进行了检验;采用实时荧光定量PCR (Real-time) 方法检测了SRPK3在1日龄和30日龄大白猪及杜洛克的心脏、肌肉、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、小肠、大肠、脑的表达情况;采用皮下注射的方式构建猪骨骼肌损伤模型用于研究在骨骼肌修复过程中SRPK3基因表达特性。经拼接所得到的1 708bp核苷酸片段,涵盖了SRPK3基因的全长CDS (1 701bp),该基因编码含567个氨基酸片段;蛋白存在两个S_TKc结构域,猪SRPK3蛋白序列与人和牛的相似性较高。PCR-SSCP检测发现第6外显子上A⁶²⁹→G⁶²⁹,T⁶⁵³→T⁶⁵³的突变,氨基酸变化为Pro→His,Ile→Thr;第9外显子处的G¹⁰⁵⁹→ A¹⁰⁵⁹,氨基酸无突变。利用荧光定量PCR研究发现,表达结果显示该基因表达具有组织和种间特异性。SRPK3基因的表达在整个骨骼肌细胞损伤修复过程中逐渐升高。SRPK3基因主要在肌肉和心肌内表达,骨骼肌损伤修复过程中伴随骨骼肌细胞分化SRPK3的表达持续升高,推测其可能与骨骼肌细胞发育相关。     

Relationship between mitochondrial DNA Copy Number and SIRT1 Expression in Porcine Oocytes

The present study assessed the effect of resveratrol on the expression of SIRT1 and mitochondrial quality and quantity in porcine oocytes. Supplementing the maturation medium with 20 µM resveratrol increased the expression of SIRT1, and enhanced mitochondrial functions, as observed from the increased ATP content and mitochondrial membrane potential. Addition of resveratrol also improved the ability of oocytes to develop into the blastocyst stage following activation. The effects of resveratrol on mitochondrial number were examined by comparing the mitochondrial DNA copy number (Mt number) between group of oocytes collected from the same donor gilt ovaries. Supplementing the maturation medium with only resveratrol did not affect the Mt number in the oocytes. However, supplementing the maturation medium with 10 µM MG132, a proteasome inhibitor, significantly increased the amount of ubiquitinated proteins and Mt number by 12 and 14%, respectively. In addition, when resveratrol was added to the medium containing MG132, the Mt number increased significantly by 39%, this effect was diminished by the addition of the SIRT1 inhibitor EX527. Furthermore, supplementing the medium with MG132 and EX527 did not affect Mt number. The mean SIRT1 expression in 20 oocytes was significantly and positively correlated with the Mt number in oocytes collected from the same donor. This study suggests that the expression of SIRT1 is associated with the Mt number in oocytes. In addition, activation of SIRT1 by resveratrol enhances the biosynthesis and degradation of mitochondria in oocytes, thereby replenishing and improving mitochondrial function and the developmental ability of oocytes.     

PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)的克隆及其原核表达

目的:采用基冈工程手段表达PRRSV VR 2332菌株的核农壳蛋白(N蛋白).方法:利用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR 2332菌株的核衣壳蛋白(N蛋白)基冈并将其克降到原核表达载pET30a( )上,得到重组质粒rpEI30a-PRRSV/N,并将其转入受体菌E.coli B121(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析表达产物的特性.结果:SDS-PAGE电泳检测和Western blotting分析结果表明,表达的蛋白大小约为19kDa,符合预期结果,并能与抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体发生特异性反应,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性,可应用于临床PRRSV抗体的检测.结论:在大肠杆菌表达系统内成功表达了PRRSV核农壳蛋白(N蛋白).     

硒蛋白Sep15基因克隆、定点突变及其原核表达

克隆鉴定猪硒蛋白Sep15基因( Sep15 ),将其突变实现原核表达,为以猪为模型研究Sep15功能奠定基础。实验以RT-PCR从猪脾总RNA扩增出含开放阅读框(ORF)至poly(A)共1230 bp的 Sep15 cDNA,3'-非翻译区Sec插入元件为2型,489 bp的ORF及对应氨基酸序列与人相应序列的相似度分别为85.1%和92.7%,ORF含一个硒代半胱氨酸(Sec)密码子TGA,定点突变为半胱氨酸(Cys)的TGC后,经载体pET30转入大肠杆菌BL21(DE3),0.4 mmol/L IPTG诱导表达3 h获得融合表达产物;该产物在Western blot检测中与人Sep15 Sec下游肽段的商品化多抗产生特异性免疫印迹。猪 Sep15 被首次成功克隆并鉴定,其Cys突变体的原核表达产物与人Sep15 C-端抗体存在交叉免疫反应。     

青岛文昌鱼LIM类基因Bblim同源框区的cDNA克隆、序列分析及其在胚胎发育中的表达(英文)

不同卵裂球发育命运的特化、亦即胚胎细胞的分化是动物胚胎发育的重要特征。多数胚胎细胞尽管形态特征完全一致,却具有完全不同的发育命运。预示着：在这些细胞中存在有决定发育命运的因素———决定子。本工作克隆了青岛文昌鱼ＬＩＭ类同源框基因的同源框片段。目的在于揭示决定子的分子本质。青岛近海采集性成熟的成年青岛文昌鱼,收集未受精卵、受精卵以及各个不同时期的胚胎,液氮冻存备用。分别制备总ＲＮＡ。根据其它动物ＬＩＭ类同源框基因的序列设计引物（Ｔａｂ．１）,连续进行ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ两次扩增。其中,原肠胚来源的第二次ＰＣＲ产物经电泳鉴定（Ｆｉｇ．１）后,酶切、克隆入质粒、测序、将该片段所在的基因命名为Ｂｂｌｉｍ基因,该片段称为Ｂｂｌｉｍ同源框。根据Ｂｂｌｉｍ基因同源框的核苷酸序列推导出其相应的氨基酸序列（Ｆｉｇ．２）,与其它ＬＩＭ类同源框基因进行比较（Ｆｉｇ．３）后,认为：Ｂｂｌｉｍ基因可归入ｌｉｍ３类基因。比较胚胎发育各个不同时期第二次ＰＣＲ产物的含量———即Ｂｂｌｉｍ基因的转录（Ｆｉｇ．４）,提示：该基因可能在受·精·后·和·原·肠·形·成·期·前·后·两个发育阶段起作用。此外,Ｂｂｌｉｍ基因的同源域与海鞘Ｈｒｌｉｍ的     

干扰素α应答基因的克隆及在兔早期胚胎发育中功能分析

干扰素(interferon,IFN)在哺乳动物早期胚胎发育过程中具有重要的生理功能,但是其作用机制尚不清楚.通过筛选卵巢cDNA文库和5′-RACE方法,克隆了兔卵巢干扰素α应答基因(interferonresponsivegene,IFRG)的全长cDNA(登录号:AJ584672).利用RT-PCR证明IFRG在兔卵母细胞和植入前胚胎中均有表达,这将为深入研究IFN在早期胚胎中的作用机制提供理论参考,卵巢原位杂交表明IFRG在成熟卵泡(类型5)的颗粒细胞中有表达,在初级和次级卵泡的膜鞘细胞和粒层细胞中有很高的表达,鉴于这些细胞与卵泡的发育密切相关,推测IFRG在卵泡的发育、成熟和排卵中发挥重要作用.     

辣椒ATP硫酸化酶基因（CaATPS1）的克隆与逆境表达

采用 RT-PCR和RACE方法,克隆了叶绿体ATP硫酸化酶基因的全长序列,命名为CaATPS1,GenBank 登录号为KX009745。该基因包含1个长为1 377 bp的完整开放阅读框,编码 458个氨基酸,预测分子量51.11 kD,等电点6.74。氨基酸同源性分析表明,该基因与 GenBank 中登录的茄科植物烟草、马铃薯及其它物种中的ATPS1氨基酸序列具有较高的同源性;进化树分析表明,辣椒CaATPS1与同为茄科属的烟草、马铃薯和胡麻属的芝麻处于同一进化分枝上,而与十字花科植物进化关系较远;荧光定量PCR分析显示,CaATPS1能被低温、干旱、高盐、机械损伤、过氧化氢、水杨酸、乙烯利以及DC3000侵染等各种胁迫和信号分子诱导。     

棉花GhAQP1基因克隆及其在胚珠发育中的特异表达

从棉花cDNA文库中筛选分离了1个编码PIP1类水孔蛋白的CDNA序列,编码287个氨基酸,命名为GhAQP1。该基因全长2096bp,编码区内含有2个内含子,分别位于编码第五和第六跨膜螺旋的碱基序列内。Northern杂交结果显示,GhAQP1基因主要在胚珠中表达,在开花后9d的胚珠中表达量最高,表明其表达不仅具有组织特异性,而且是受胚珠发育调节的。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

玉米类受体蛋白激酶基因ZmLRRPK1的cDNA克隆与表达分析

富亮氨酸重复区的类受体蛋白激酶(LRR-RLKs)在植物对多种信号的响应中发挥作用。应用电子克隆的方法在玉米中克隆了一个LRR-RLKs类基因的全长cDNA,命名为ZmLRRPK1（GenBank接受号为EU873320）。推断的ZmLRRPK1蛋白含有594个氨基酸,分子量为66kDa,等电点pI为5.42,具有典型的LRR-RLKs结构域。半定量RT-PCR结果表明,在ABA、甘露醇和氯化钠的诱导下,ZmLRRPK1在玉米胚芽鞘中表达并在24 h内保持较高的转录水平。