泛素化修饰组学技术及其在疾病研究中的应用

泛素化修饰作为真核细胞内主要的蛋白质翻译后修饰之一，通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)介导了细胞内的蛋白质特异性降解，同时广泛参与并调控细胞内基因转录、信号传导、DNA损伤与修复、细胞周期调控、应激反应甚至个体的免疫应答等几乎所有的生命活动过程。泛素-蛋白酶体系统的精确调控构成了稳定而复杂的泛素化信号网络，而其失调通常会造成癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病等多种疾病的发生发展。近年来，基于质谱(MS)的蛋白质组学逐渐成熟，并极大促进了泛素化修饰研究的深度与广度。依托于泛素化蛋白质/肽段富集技术的发展以及高通量、高覆盖度和高灵敏度的质谱检测技术平台，蛋白质泛素化修饰组学也得以快速发展，并逐渐应用于人类生理、病理状态的泛素化蛋白质组研究和疾病发生发展的机制探索。本文主要综述了泛素化修饰组学研究中的泛素化蛋白质/肽段富集方法、质谱鉴定技术、定量标记技术和数据处理方法，同时对泛素化修饰组学技术在疾病研究中的应用也进行了系统分析，理清了当前存在的问题与挑战，为泛素化修饰蛋白质的发现与鉴定提供参考，为相关疾病治疗靶点的筛选和药物研发提供思路。     

去泛素化酶在乳腺癌中的研究新进展

泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome-system,UPS)是控制蛋白质降解的主要系统,也是细胞基本活动的关键调节器。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)是泛素-蛋白酶体系统的组成部分,主要参与调节蛋白质泛素化和去泛素化的动态平衡,对细胞增殖、信号转导、神经病变或肿瘤发生意义重大。不同的DUBs在乳腺癌中的作用不同,最新发现去泛素化酶BAP1、OTUD3、ATXN3L主要调节乳腺癌细胞增殖,某些DUBs小分子抑制剂可以间接诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡。本文主要综述这三个DUBs及去泛素化酶抑制剂在乳腺癌中的研究新进展,为寻找新型的乳腺癌分子靶向药物提供理论依据。     

泛素连接酶和去泛素化酶在帕金森病中的作用

中脑黑质多巴胺能神经元特异性损伤和α突触核蛋白聚集的分子机制是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）研究领域亟待解决的问题。蛋白质异常聚集很大程度上是由于泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）功能障碍引起的。蛋白质泛素化由一系列泛素化酶级联反应促进，并受去泛素化酶（deubiquitylases,DUBs）的反向调节。泛素化和去泛素化过程异常导致蛋白质异常聚集和包涵体形成，进而损伤神经元。近来研究报道，蛋白质的泛素化和去泛素化修饰在PD的发病机制中发挥重要作用。E3泛素连接酶促进蛋白质的泛素化，有利于α突触核蛋白的清除、促进多巴胺能神经元的存活、维持线粒体的功能等。DUBs可以去掉底物蛋白质的泛素化修饰，抑制α突触核蛋白的降解，调控线粒体的功能和神经元内铁的稳态。本文以E3泛素连接酶和DUBs为切入点，综述了蛋白质泛素化和去泛素化修饰参与多巴胺能神经元损伤机制的最新研究进展。     

O-GlcNAc修饰对蛋白质泛素化降解途径的影响

O-GlcNAc修饰是一种特殊的糖基化修饰,几乎参与生物体内所有细胞过程的调控。该修饰与泛素化作为两种重要的蛋白质翻译后修饰形式,都与2型糖尿病、神经退行性疾病、癌症等疾病密切相关。O-GlcNAc修饰对蛋白质泛素化降解途径的影响主要体现在4个方面:(1)O-GlcNAc修饰能够抑制26S蛋白酶体的ATPase活性;(2)O-GlcNAc修饰会减少某些底物蛋白的泛素化降解;(3)O-GlcNAc修饰泛素化相关酶并调节其功能;(4)某些蛋白质(包括调控因子)发生O-GlcNAc修饰后间接影响蛋白质泛素化。     

泛素化介导的非蛋白质降解功能

泛素因标记被26 S蛋白酶体降解的蛋白质而著名．然而近几年发现,泛素作用远不止此,不仅具有参与蛋白质降解这一重要“传统作用”,还起着比先前想象更多变的、更精美的细胞调控作用,是非常重要的细胞过程的多层面调节因子,具有许多重要的非蛋白质降解功能,包括DNA损伤修复、DNA复制、信号传导、转录调节、膜运输、胞吞、蛋白激酶活化、染色质重塑和病毒芽殖．这些功能涉及多聚泛素化和单泛素化及多泛素化．因此,泛素化异常可能涉及疾病的发生和发展．对这些功能的了解可以拓展人们对泛素的认识,有助于对多种细胞过程的深入理解,也有助于相关新药的研发．     

去泛素化酶在卵巢癌发生发展中的作用CSCD

泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的重要方式,调节蛋白质稳定性。去泛素化酶可以识别特定蛋白质的泛素化信号从而使底物蛋白质去泛素化,逆转蛋白质泛素化过程,进而调控细胞增殖、分化、凋亡和迁移等多种生物学功能。去泛素化酶家族的多个成员通过影响细胞增殖凋亡及对化疗药物的敏感性等,在卵巢癌的发生发展中发挥十分重要的作用。一些小分子抑制剂通过抑制去泛素化酶的活性从而起到抗肿瘤的作用,并且具有特异性强,细胞毒性较弱等优势。本综述对参与卵巢癌发生发展的去泛素化酶以及相关的小分子抑制剂做一个全面的总结,为卵巢癌的诊断和治疗提供一个新的方向。     

原核生物类泛素蛋白Pup-蛋白酶体系统的研究进展

真核泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的重要机制,参与细胞生理功能调控,因此泛素-蛋白酶体通路的机制和功能研究备受关注.20世纪80年代,人们就发现放线菌中存在原核蛋白酶体,但是对于原核蛋白酶体的功能和作用机理长期以来了解甚少.2008年,Pearce等在结核分枝杆菌中发现了原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup).在Dop、PafA、Mpa等辅助因子的作用下,Pup可以共价标记多种功能蛋白,并介导被标记蛋白质通过蛋白酶体降解,Pup-蛋白酶体系统的发现揭示了原核生物中一个崭新的蛋白质降解机制.Pup-蛋白酶体系统的靶蛋白涉及物质中间代谢、信号通路、毒性和抗毒性因子、细胞壁和细胞膜组分等多个方面,并且与结核分枝杆菌的致病性相关,被认为是新的结核病治疗药物靶点.本文就原核Pup-蛋白酶体系统的作用机理及其功能的研究进展作一综述.     

病原菌效应因子调控宿主泛素化修饰的研究进展北大核心

泛素化(ubiquitination)是真核细胞内广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式,参与并调控DNA修复、细胞周期、免疫应答、信号通路等真核细胞内几乎所有的生命活动。同时,细胞通过去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)使泛素化修饰成为可逆过程,保证了泛素化系统及其相关生理过程的动态平衡。病原菌感染过程中,宿主细胞可通过泛素化修饰发挥抗细菌感染作用。然而,病原菌可编码并分泌效应因子,靶向宿主泛素(ubiquitin,Ub)系统并调控宿主泛素化修饰过程,干扰宿主细胞的免疫应答,从而促进细菌存活与毒力。本文概述了重要病原菌利用效应因子调控宿主细胞泛素化修饰的研究进展,有助于全面理解病原菌调控宿主泛素化修饰促进感染的机制。     

泛素化修饰调控脱落酸介导的信号途径

泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,通过调节蛋白的活性和稳定性等影响其功能的发挥,在真核生物的生命过程中具有非常重要的作用。泛素化修饰通过精细地调控植物激素脱落酸(abscisic acid, ABA)的合成和信号转导过程的关键因子,影响植物对ABA的响应,参与植物生长发育过程及对干旱、盐和冷胁迫等不良环境的应答。本文概述了植物中泛素化修饰的相关组分(包括泛素连接酶E3、泛素结合酶E2、26S蛋白酶体)和内膜运输相关蛋白,以及这些蛋白调控ABA合成和信号转导过程的最新研究进展,提出该研究领域需要解决的新问题,以期为相关领域的科研人员进一步了解翻译后修饰如何调控激素信号的转导途径提供参考。     

蛋白质SUMO化和泛素化修饰的关系

泛素化和SUMO化是蛋白质翻译后修饰的重要方式,广泛参与调节蛋白质功能和细胞生命活动各个环节。多聚泛素化降解蛋白质,而SUMO化主要调节蛋白质的相互作用和定位等。在不同情况下,SUMO化和泛素化既可协同调节蛋白质功能,也可相互拮抗。最近研究发现,某些底物的SUMO化能够激活体内一类新发现的SUMO依赖的泛素连接酶,启动泛素-蛋白酶体途径降解底物,导致蛋白质SUMO化和汔素化的关系进一步精细化和复杂化。     

Mutations in PINK1 and Parkin impair ubiquitination of Mitofusins in human fibroblasts

PINK1 and Parkin mutations cause recessive Parkinson's disease (PD). In Drosophila and SH-SY5Y cells, Parkin is recruited by PINK1 to damaged mitochondria, where it ubiquitinates Mitofusins and consequently promotes mitochondrial fission and mitophagy.Here, we investigated the impact of mutations in endogenous PINK1 and Parkin on the ubiquitination of mitochondrial fusion and fission factors and the mitochondrial network structure. Treating control fibroblasts with mitochondrial membrane potential (Δψ) inhibitors or H(2)O(2) resulted in ubiquitination of Mfn1/2 but not of OPA1 or Fis1. Ubiquitination of Mitofusins through the PINK1/Parkin pathway was observed within 1 h of treatment. Upon combined inhibition of Δψ and the ubiquitin proteasome system (UPS), no ubiquitination of Mitofusins was detected. Regarding morphological changes, we observed a trend towards increased mitochondrial branching in PD patient cells upon mitochondrial stress.For the first time in PD patient-derived cells, we demonstrate that mutations in PINK1 and Parkin impair ubiquitination of Mitofusins. In the presence of UPS inhibitors, ubiquitinated Mitofusin is deubiquitinated by the UPS but not degraded, suggesting that the UPS is involved in Mitofusin degradation.     

泛素化和磷酸化协同作用调控蛋白质降解

在真核细胞中,泛素化和磷酸化是2种常见的蛋白质修饰方式。泛素在蛋白酶体降解途径中发挥重要的靶向作用,细胞外信号严格调控着目的蛋白的泛素化。在很多情况下,这种调控依赖于蛋白质的磷酸化。由磷酸化影响的调控步骤可能与E3泛素连接酶对底物的识别有关,也可能与实际的交联反应有关。这种调控是通过对底物或E3连接酶本身的磷酸化实现的。     

Roles of ubiquitination at the synapse

The ubiquitin proteasome system (UPS) was first described as a mechanism for protein degradation more than three decades ago, but the critical roles of the UPS in regulating neuronal synapses have only recently begun to be revealed. Targeted ubiquitination of synaptic proteins affects multiple facets of the synapse throughout its life cycle; from synaptogenesis and synapse elimination to activity-dependent synaptic plasticity and remodeling. The recent identification of specific UPS molecular pathways that act locally at the synapse illustrates the exquisite specificity of ubiquitination in regulating synaptic protein trafficking and degradation events. Synaptic activity has also been shown to determine the subcellular distribution and composition of the proteasome, providing additional mechanisms for locally regulating synaptic protein degradation. Together these advances reveal that tight control of protein turnover plays a conserved, central role in establishing and modulating synapses in neural circuits.     

组蛋白的泛素化与去泛素化修饰

泛素在真核生物体内广泛存在,泛素化修饰是转录后的修饰方式之一;组蛋白是染色质的主要成分之一,与基因的表达有密切关系。组蛋白的泛素化修饰与经典的蛋白质的泛素调节途径不同,不会导致蛋白质的降解,但是能够招募核小体到染色体、参与X染色体的失活、影响组蛋白的甲基化和基因的转录。组蛋白的去泛素化修饰同样与染色质的结构及基因表达密切相关。组蛋白的泛素化和磷酸化、乙酰化、甲基化修饰之间还存在协同和级联效应。     

Mature ribosomes are selectively degraded upon starvation by an autophagy pathway requiring the Ubp3p/Bre5p ubiquitin protease

Eukaryotic cells use autophagy and the ubiquitin-proteasome system (UPS) as their major protein degradation pathways. Whereas the UPS is required for the rapid degradation of proteins when fast adaptation is needed, autophagy pathways selectively remove protein aggregates and damaged or excess organelles. However, little is known about the targets and mechanisms that provide specificity to this process. Here we show that mature ribosomes are rapidly degraded by autophagy upon nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Surprisingly, this degradation not only occurs by a non-selective mechanism, but also involves a novel type of selective autophagy, which we term 'ribophagy'. A genetic screen revealed that selective degradation of ribosomes requires catalytic activity of the Ubp3p/Bre5p ubiquitin protease. Although ubp3Delta and bre5Delta cells strongly accumulate 60S ribosomal particles upon starvation, they are proficient in starvation sensing and in general trafficking and autophagy pathways. Moreover, ubiquitination of several ribosomal subunits and/or ribosome-associated proteins was specifically enriched in ubp3Delta cells, suggesting that the regulation of ribophagy by ubiquitination may be direct. Interestingly, ubp3Delta cells are sensitive to rapamycin and nutrient starvation, implying that selective degradation of ribosomes is functionally important in vivo. Taken together, our results suggest a link between ubiquitination and the regulated degradation of mature ribosomes by autophagy.     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。     

快速高效检测植物体内蛋白泛素化修饰研究方法

UPS参与植物中绝大多数的信号转导通路。其中, 一些激素的受体本身就是E3泛素连接酶, 如茉莉酸(JA)受体COI1和生长素(auxin)受体TIR1都是F-box蛋白, 它们通过特异性介导相应转录抑制子的泛素化降解来传递激素信号, 但对于整个UPS体系而言, 由于技术的限制, 迄今为止仅见少量泛素连接酶与特异性底物间生化机制的报道。用大肠杆菌(Escherichia coli)表达蛋白实施泛素连接酶泛素化修饰底物的体外实验是验证泛素连接酶/底物对的常用方法, 但由于体外实验缺乏某些蛋白必需的转录后修饰, 导致实验结果有时存在假阴性。利用农杆菌注射烟草(Nicotiana benthamiana)瞬时表达蛋白的方法, 建立高效的植物体内检测蛋白泛素化系统, 可以快速检测蛋白泛素化, 包括检测泛素连接酶和底物的特异性相互作用、底物蛋白的自身泛素化、泛素连接酶对底物降解的促进作用、26S蛋白酶体抑制剂MG132对底物降解的抑制作用以及用植物内源表达蛋白进行体外泛素化反应。