SRAP技术在遗传的研究进展

SRAP是一种新型的DNA分子标记,具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列的特点。SRAP利用独特的引物设计对开放读码框(ORFs)进行扩增,上游引物长17bp,对外显子进行特异扩增,下游引物长18bp,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增,因个体不同及其物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。本文阐述SRAP的原理和操作流程,综述了SRAP标记目前在植物遗传图谱构建、遗传多样性、基因定位、基因克隆、杂种优势利用等方面的研究进展及应用前景。     

功能型分子标记（ISAP）的开发及评价功能型分子标记（ISAP）的开发及评价

分子标记在图谱构建,QTL分析,基因定位以及标记辅助育种中起着越来越重要的作用。研究者都期望一个分子标记位点代表一个特定的基因,甚至与某种性状联系起来,这样,通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行筛选,此即功能型分子标记。而目前广泛使用的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSR、AFLP等或是扩增非编码区域,或是随机在基因组中扩增,得到的位点一般与目标性状基因距离较远,这使得分子标记在应用上与其目标有一定的偏差。研究建立了一种基于基因中内含子序列的功能型分子标记,试图使标记位点与基因序列联系起来以达到其功能型的目的。它利用内含子剪接位置的保守一致序列作为其引物的核心序列,其上下游引物均为18bp,上下游引物间通过组合配对的方式作为扩增的引物对,对真核生物的基因序列进行扩增。为了验证ISAP的功能性,研究设计了17条引物（9条上游引物,8条下游引物,共计72个引物组合）对棉花F2群体进行扩增并构建遗传连锁图谱,其中67个显示了多态性,共得到212个位点。我们用此212个位点连同164个SRAP位点构建了一张包含276个位点的遗传连锁图谱,ISAP标记在整个连锁群中分布比较均匀,部分区域呈现标记高饱和现象,可能为编码序列富集区。另外对20个片段进行测序的结果表明,85%的序列显示了与已公布EST序列的同源性,说明扩增是跨越了外显子进行的,得到的序列与表达序列紧密连锁。结果显示,ISAP标记是简单,可靠,具有较高多态性,并且扩增基因区域的一种功能型分子标记。同时,还使用ISAP标记对其他植物进行了扩增,取得了良好的效果。     

功能型分子标记(ISAP)的开发及评价

分子标记在图谱构建, QTL分析, 基因定位以及标记辅助育种中起着越来越重要的作用。研究者都期望一个分子标记位点代表一个特定的基因, 甚至与某种性状联系起来, 这样, 通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行筛选, 此即功能型分子标记。而目前广泛使用的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSR、AFLP等或是扩增非编码区域, 或是随机在基因组中扩增, 得到的位点一般与目标性状基因距离较远,这使得分子标记在应用上与其目标有一定的偏差。研究建立了一种基于基因中内含子序列的功能型分子标记, 试图使标记位点与基因序列联系起来以达到其功能型的目的。它利用内含子剪接位置的保守一致序列作为其引物的核心序列,其上下游引物均为18 bp, 上下游引物间通过组合配对的方式作为扩增的引物对, 对真核生物的基因序列进行扩增。为了验证ISAP的功能性, 研究设计了17条引物(9条上游引物, 8条下游引物, 共计72个引物组合)对棉花F2群体进行扩增并构建遗传连锁图谱, 其中67个显示了多态性, 共得到212个位点。我们用此212个位点连同164个SRAP位点构建了一张包含276个位点的遗传连锁图谱, ISAP标记在整个连锁群中分布比较均匀,部分区域呈现标记高饱和现象, 可能为编码序列富集区。另外对20个片段进行测序的结果表明, 85％的序列显示了与已公布EST序列的同源性, 说明扩增是跨越了外显子进行的, 得到的序列与表达序列紧密连锁。结果显示, ISAP标记是简单, 可靠, 具有较高多态性, 并且扩增基因区域的一种功能型分子标记。同时, 还使用ISAP标记对其他植物进行了扩增, 取得了良好的效果。     

S-SAP分子标记开发及其在苹果芽变鉴别上的应用

S-SAP(特异序列扩增多态性,Ssequence specific amplification polymorphism)是一种基于反转录转座元件的广泛应用于生物遗传多样性研究的分子标记。本研究从34对引物中筛选出7对具有谱带清晰、多态性高的引物组合,成功地开发了苹果基因组的S-SAP分子标记。27个元帅系芽变品种中,共扩增出588条谱带,每对引物组合平均扩增出84条谱带,其中多态性谱带48条,多态性谱带占总扩增出谱带数的8.2%,遗传相似系数介于0.73～0.90之间。对15个苹果芽变品种进行S-SAP分析,相似系数在0.42～0.94之间,以相似系数0.80为阈值,可以区分各芽变品系。开发的S-SAP分子标记可以有效地将苹果芽变品种区分,并为苹果生物遗传多样性与系统进化、品种鉴定提供新方法。     

红掌品种亲缘关系SRAP分析

利用相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记,从100对引物组合中筛选出 26对多态性高、条带清晰的SRAP引物,对33个红掌品种进行遗传多样性和亲缘关系分析。结果如下：（1）26对引物共扩增出366条条带,其中有314条多态性条带,多态性比率为85.79%。引物组合产生的条带数在9～23之间,平均每对引物组合扩增出14.1条和12.1条多态性条带。（2）根据SRAP扩增结果,利用UPGMA法进行聚类分析,33份材料的遗传相似系数在0.55～0.94之间,在遗传相似系数0.786处可将33个红掌品种分为5个类群。结果表明,供试品种遗传多样性丰富,本研究为品种鉴定和杂交育种提供了参考信息。     

甘蓝SSR标记在近缘种青花菜的通用性及其应用

本研究对50条甘蓝SSR引物在其近缘种青花菜中的通用性进行了分析,结果表明,38对引物在青花菜上可有效扩增,扩增产物分子量在100～1500bp,有效扩增比率为76%,其中18%具有较好的多态性,揭示了两种作物基因组间存在一定的相似性。同时利用获得的多态性较好的9对引物对青花菜进行基因型鉴定和遗传多样性分析,20份青花菜基因型中共检测到51个基因位点,平均每个引物组合可扩增出5.67个条带,多态性为66.7%。多引物组合可鉴别出所有青花菜基因型。聚类分析结果表明同一来源的基因型间具有相近的遗传基础,且聚类与熟性具有一定的相关性。本研究为今后青花菜种质资源的收集、利用及分子标记辅助育种提供了新的SSR标记和参考。     

新型标记SRAP在棉花F2分离群体及遗传多样性评价中的适用性分析

将新型分子标记SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism)应用于棉花的遗传研究,并建立了完整的PCR反应体系,此体系稳定可靠、扩增效果好、可重复性强。采用30个SRAP引物组合对海岛棉品种“Pima90”和陆地棉品种“邯郸208”进行比较扩增,29个引物组合可以获得多态性扩增,显示了较高的多态性。对上述两个品种的F2群体进行检测,共产生149个多态性条带,平均每个组合产生5．14个,单引物组合最多可产生13个多态性条带。用SRAP标记对11份陆地棉材料进行遗传多样性检测,30个引物组合中15个组合有多态性,得到22个多态性条带,显示了较高的多态性比率。研究结果表明,SRAP标记可在棉花分子生物学领域中广泛应用。     

一种新的DNA分子标记技术——起始密码子-微卫星扩增多态性

综合SCoT和ISSR分子标记技术开发了一种既能将标记位点与表达序列紧密联系,又具有相对较高的多态性的新的分子标记技术——起始密码子一微卫星扩增多态性（start codon-simple sequence repeat, SC-SSR）。SC—SSR标记是基于PCR的目的基因标记系统．上游引物用SCoT标记引物,瞄准基因区域,下游引物用ISSR标记引物,上下游引物间可自由组配。引物设计原则同SCoT标记和ISSR标记。使用50℃的退火温度,保证了扩增结果的稳定性。PCR结果采用琼脂糖凝胶电冰和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。SC—SSR分子标记结合了ISSR标记和SCoT标记的优点,具有操作简单、成本低廉、多态性丰富、重复性好、引物设计简单且通用性良好、同时与表达序列紧密连锁等诸多优点,可用于种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、gDNA与cDNA指纹分析乃至图位克隆等方面。     

不同种源乌拉尔甘草形态和ISSR遗传多样性研究

利用形态学指标对34份乌拉尔甘草种质资源进行遗传多样性分析,结果表明,34份甘草在7个性状上差异均达到了极显著水平,主要是由以内蒙古和新疆种源为主的两大组群之间形态特性差异明显。在分子标记中,从100条核甘酸序列中筛选出18条ISSR多态性引物,对46份乌拉尔甘草种质资源进行了遗传多样性分析,研究结果表明:①我国乌拉尔甘草种质资源遗传变异十分丰富,18条引物共扩增出210条多态性带,分布在150~3000bp之间,平均每个引物扩增出11.67条;②新疆地区乌拉尔甘草遗传变异最为丰富,其次是西北地区,东北地区遗传变异最低;③基于ISSR分子标记划分的组群与地域性没有明显关系。     

观叶福禄桐遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR分子标记对9个观叶福禄桐品种进行遗传多样性和亲缘关系分析,从100条引物中筛选出9条稳定、多态性高的引物用于PCR扩增,共获得70条带,其中多态性条带61条,多态百分率为87.14%。聚类结果显示,品种间相似性系数为0.346 9-0.816 3,聚类结果与品种间的地理来源紧密相关,从外观形态上比较,亲缘性较近的叶形和株型相似性较高;观叶福禄桐各品种间基因型差异较小,亲缘关系较近,遗传基础相对较窄。     

Target region amplification polymorphism: A novel marker technique for plant genotyping

The advent of large-scale DNA sequencing technology has generated a tremendous amount of sequence information for many important organisms. We have developed a rapid and efficient PCR-based technique, which uses bioinformatics tools and expressed sequence tag (EST) database information to generate polymorphic markers around targeted candidate gene sequences. This target region amplification polymorphism (TRAP) technique uses 2 primers of 18 nucleotides to generate markers. One of the primers, the fixed primer, is designed from the targeted EST sequence in the database; the second primer, the arbitrary primer, is an arbitrary sequence with either an AT-or GC-rich core to anneal with an intron or exon, respectively. PCR amplification is run for the first 5 cycles with an annealing temperature of 35°C, followed by 35 cycles with an annealing temperature of 50°C. For different plant species, each PCR reaction can generate as many as 50 scorable fragments with sizes ranging from 50–900 bp when separated on a 6.5% polyacrylamide sequencing gel. The TRAP technique should be useful in genotyping germplasm collections and in tagging genes governing desirable agronomic traits of crop plants.     

珍稀植物杨叶肖槿ISSR体系建立及检测

针对珍稀植物杨叶肖槿ISSR反应的特点,建立了适用于杨叶肖槿遗传多样性研究的ISSR最适反应体系,具体包括:2.0μL 10×Buffer,27.5ng的模板DNA,2.0μL的dNTP,1U的Pyrobest DNA酶,1.25μmol/L的引物;最佳反应程序为94℃预变性5min,然后94℃变性1min,49℃退火45s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸10min,4℃终止反应。应用该优化的反应体系筛选出了10条稳定性强、清晰度高而且表现出一定多态性的ISSR引物,并对杨叶肖槿进行了检测,获得了清晰稳定的扩增图谱。     

Start Codon Targeted (SCoT) Polymorphism: A Simple,Novel DNA Marker Technique for Generating Gene-Targeted Markers in Plants

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers have been used for numerous applications in plant molecular genetics research despite having disadvantages of poor reproducibility and not generally being associated with gene regions. A novel method for generating plant DNA markers was developed based on the short conserved region flanking the ATG start codon in plant genes. This method uses single 18-mer primers in single primer polymerase chain reaction (PCR) and an annealing temperature of 50°C. PCR amplicons are resolved using standard agarose gel electrophoresis. This method was validated in rice using a genetically diverse set of genotypes and a backcross population. Reproducibility was evaluated by using duplicate samples and conducting PCR on different days. Start codon targeted (SCoT) markers were generally reproducible but exceptions indicated that primer length and annealing temperature are not the sole factors determining reproducibility. SCoT marker PCR amplification profiles indicated dominant marker like RAPD markers. We propose that this method could be used in conjunction with these markers for applications such as genetic analysis, bulked segregant analysis, and quantitative trait loci mapping, especially in laboratories with a preference for agarose gel electrophoresis.     

Effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number on 16S rRNA gene-targetting bacterial community analysis

In the attempt to explore complex bacterial communities of environmental samples, primers hybridizing to phylogenetically highly conserved regions of 16S rRNA genes are widely used, but differential amplification is a recognized problem. The biases associated with preferential amplification of multitemplate PCR were investigated using 'universal' bacteria-specific primers, focusing on the effect of primer mismatch, annealing temperature and PCR cycle number. The distortion of the template-to-product ratio was measured using predefined template mixtures and environmental samples by terminal restriction fragment length polymorphism analysis. When a 1 : 1 genomic DNA template mixture of two strains was used, primer mismatches inherent in the 63F primer presented a serious bias, showing preferential amplification of the template containing the perfectly matching sequence. The extent of the preferential amplification showed an almost exponential relation with increasing annealing temperature from 47 to 61 degrees C. No negative effect of the various annealing temperatures was observed with the 27F primer, with no mismatches with the target sequences. The number of PCR cycles had little influence on the template-to-product ratios. As a result of additional tests on environmental samples, the use of a low annealing temperature is recommended in order to significantly reduce preferential amplification while maintaining the specificity of PCR.     

华顶杜鹃ISSR反应体系的优化及亲缘关系的初步分析

以华顶杜鹃为材料,利用单因素试验确立适合华顶杜鹃ISSR-PCR的优化反应体系:在25μL反应体系中,Mg2+1.5或2.0mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,引物0.40μmol/L,Taq DNA聚合酶lU,模板DNA 40ng;分析ISSR-PCR反应体系中Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度对ISSR-PCR反应的影响。PCR扩增程序:预变性94℃ 3min;变性94℃ 45s;退火(Tm+2)℃(根据引物不同设定)75s;延伸72℃ 1.5min;40个循环;继续延伸72℃ 10min;1.5%琼脂糖电泳分离PCR产物。并以优化好的体系初步分析华顶杜鹃及5个近缘种(茶绒杜鹃、Rhododendron mayebrae、Rh.sataense、南平杜鹃和映山红)的亲缘关系,6个种明显地聚为2大类:A类含有映山红、南平杜鹃;B类含有茶绒杜鹃、Rh.sataense、Rh.mayebrae与华顶杜鹃,为明确华顶杜鹃的系统地位提供可借鉴的依据。     

唐古特大黄ISSR-PCR反应条件的优化

利用单因素试验对影响唐古特大黄ISSR-PCR扩增的重要参数进行优化,以期建立其最佳反应条件。结果如下:20μL反应体系包括1.5×PCR buffer(15mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl),1.00mmol/LMgCl2,0.6UTaq DNA聚合酶,0.125mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物和30ng模板DNA;引物UBC888适宜的退火温度为57.4℃。ISSR反应条件的建立为利用分子标记技术研究唐古特大黄居群遗传多样性奠定了良好基础。     

An abnormally long HIV-1 env DNA PCR product due to altered sequences of primer binding sites

To investigate the generation of an abnormally long HIV-1 env PCR DNA product the latter was cloned and sequenced followed by sequence analysis of HIV-1 primer binding sites. We found that the formation of an abnormally long PCR product was due to HIV-1 env sequence alteration (a) in the reverse primer binding site resulting in faulty primer binding and (b) downstream from the forward primer sequence resulting in a new binding site with reverse complementary sequence with respect to the forward primer at the opposite end of the PCR product. Both changes led to amplification of a longer PCR product with forward primer alone. Our results indicate that the HIV-1 genetic diversity in the env gene can lead to amplification of a specific PCR product of unexpected size which can be disregarded in the absence of its cross-validation.     

Targeted gene walking polymerase chain reaction.

We describe a modification of a polymerase chain reaction method called 'targeted gene walking' that can be used for the amplification of unknown DNA sequences adjacent to a short stretch of known sequence by using the combination of a single, targeted sequence specific PCR primer with a second, nonspecific 'walking' primer. This technique can replace conventional cloning and screening methods with a single step PCR protocol to greatly expedite the isolation of sequences either upstream or downstream from a known sequence. A number of potential applications are discussed, including its utility as an alternative to cloning and screening for new genes or cDNAs, as a method for searching for polymorphic sites, restriction endonuclease or regulatory regions, and its adaptation to rapidly sequence DNA of lengthy unknown regions that are contiguous to known genes.