末端终止法测定非特异性降解的DNA片段的顺序

用末端终止法测定DNA顺序的方法之一是用限制性内切酶将被测DNA降解,再与噬菌体M_(13)DNA重组、克隆。提取单链DNA做为模板,进行顺序测定。寻找一些非特异性的降解工具取代内切酶,有一定的经济价值,而且还可以扩大方法的应用范围。尤其在多酶切点的载体M_(13)mp系列出现后,更为DNA重组提供了方便。本文用酶法及超声波法切剪,得到了适合在M_(13)mp_8载体中以平齐末端重组的片段。一、材料与方法 1.材料小牛胸腺DNA及质粒PJDB     

一种简便的双链DNA测序法

ASimpleMethodforSequencingDouble-sterandedDNATemplatesYuanHanyingLiWenLiYuyang(StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,InstituteofGenelics,FudanUniversity,Shanghai200433)随着分子生物学和基因工程研究的不断发展,快速而精确地测定DNA的序列是人们了解基因结构与功能的一项重要技术。在DNA测序技术中,口前用得较多的是利用M13、pBS系统重组单链DNA为模板,用双脱氧终止法[3]测序,对于许多不能得到单链DNA的亚组质材载体。通常以正纷双链DNA为模板进行测序,但这样就比单链DNA测序复杂得多了,首先要将双…     

快速连续测定乙肝病毒DNA酶解大片段的顺序

 用“剪切重组”术及内引物法测定了克隆在M_(13)mp_8载体中的HBVDNA 1.3Kb片段的完整顺序,简化了操作过程,为连续测定大段DNA的顺序提供了简单、快速、有效的途径。     

一种有效的DNA序列测定方法

比较了单链和双链DNA(ss和dsDNA)模板和两种不同的聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA序列测定的影响。结果表明:在相同的条件下,ssDNA模板明显优于dsDNA模板;缓冲液梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳测定DNA序列的长度在40cm长的胶上可达350nt。而一般的线性聚丙烯酰胺凝胶电泳才可测150nt。对于基因组序列分析,采用单链DNA模板和缓冲液梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种有效的测定方法。     

寡聚核苷酸诱导突变法改造φ×174噬菌体A基因蛋白的DNA识别序列

 为了进一步研究φX174噬菌体A基因蛋白的复制功能与其所识别的30核苷酸保守序列的关系,我们采用寡聚核苷酸诱导的定点突变法成功地改造了这30核苷酸保守序列。将此保守序列重组到M_(13)mp9噬菌体后,以其单链为模板,在14或16寡聚核苷酸的诱导下,合成共价闭环DNA。经转化到E.coli JM103菌株,用点印迹(Dot blot)杂交法筛选,得到两种重组突变株。一种突变株其30核苷酸保守序列正链的第22碱基由A改为G。另一突变株为其第10碱基A改为C,第11碱基T改为A。突变效率约为5％。制备了此突变株单链及双链DNA,分别做了双脱氧末端终止法及Maxam和Gilbert法序列分析鉴定。     

臭鼩高重复顺序DNA的核苷酸顺序分析及其与树鼩TSr(Bgl Ⅱ)-1顺序的比较

将臭鼩DAN经过Bam H Ⅰ酶切得到的高重复顺序DNA最小片段重组到质粒pAT153上,转化后得到了含有臭鼩BMS(Bam H Ⅰ)-1高重复顺序DNA片段的克隆。再把此片段重组到M_(13)mp19噬菌体DNA上。用末端终止法测得全部苷酸顺序为495个碱基对。对臭鼬BMS(Bam H Ⅰ)-1片段的结构特点进行了分析,并和树鼩TSr(BglⅡ)-1高重复顺序DNA进行了比较。为确定树鼩在分类学上的地位,提供了一定的分子遗传学证据。     

重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其在提高焦磷酸测序准确性中的应用

利用基因工程手段表达了分子量约为24 kDa的重组大肠杆菌单链结合蛋白 (r-SSBP),通过凝胶阻滞电泳与DNA熔解温度 (Tm) 影响实验表征了r-SSBP与单链DNA (ssDNA) 结合的特性,结果表明,r-SSBP可以与ssDNA结合,并且能够降低DNA的Tm值,同时还能增大含有单个错配碱基的DNA与完全匹配的DNA的Tm值差异,这一特性在提高单核苷酸多态性检测的特异性方面具有潜在的应用价值。此外,将r-SSBP应用于本课题组开发的高灵敏度焦磷酸测序体系中测定已知序列ssDNA模板,结果表明,r     

间接核酸杂交方法的建立

建立了一种新的核酸杂交手段一间接核酸杂交方法,其突出的优点是用一种共同的核酸标记物就可检查不同的基因组或不同的基因。我们重组乙型肝炎病毒或EB病毒的核酸片段于噬菌体M_(13)mp8载体,以此重组的单链DNA为第一夹心层,用~(32)P标记的双链噬菌体DNA作为共同探针,检查乙型肝炎病毒和EB病毒的核酸,获得满意的结果。应用该法进行细胞内的原位杂交,检查细胞内存在的EB病毒基因效果亦佳。     

高温反向顺序测定

单链克隆DNA的反向测序是一个简单和快速的方法,这个方法可利用原来的DNA再进行反向顺序测定,从而达到校正和积累DNA数据的作用。由于反向测序的本质是双链测序,所得到的DNA顺序的图谱背景较深,伴有杂带,或在x光显影上是不清晰的。本文报道利用我们实验室所开发的热稳定性的Bst聚台酶系统,进行反向测序克服了这些缺点,获得的图谱可以和单链DNA模板测序的图谱相媲美。我们以nod D 487-mp 8 ss-DNA为模板进行反向测序,证明Bst聚合酶在65℃反应能得到满意的结果。     

人神经营养因子4基因的分子克隆及序列分析

以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,PCR扩增出神经营养因子4(NT4)编码基因.将所得基因片段重组于噬菌体载体M13mp18RF,筛选得到含人NT4基因的克隆.采用Sanger单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列,该序列与国外文献所报道的完全一致.     

甘油对单链构象多态性分析的影响

单链构象多态性(single strand conformation poly-morphism,SSCP)分析是以PCR技术为基础检测DNA多态性的一种方法。其基本原理是:单链DNA在进行不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)时,迁移率除与DNA单链的长短有关外,更主要取决于DNA单链所形成的具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定,其稳定性靠分子内部局部顺序的相互作用来维持。相同长度的单链因其顺序的不同,甚至单个碱基的不同,所形成的构象不同,导致迁移率的变化而出现泳动变位(mobili-ty shift)。该方法自建立起来不断地发展、完善,应用范围也日益广泛。特别是在人类癌基因和抑癌基因突变的检测、基因诊断、连锁分析、基因作图等领域成效突出。     

Sanger链中止法的新进展——以M13为克隆的运载体进行DNA序列分析(续)

三.M13mpX复制形式(RF)的制备(图1-3) 虽然M13mpX是单链的噬菌体,一旦它感染到寄主细胞后,便成为双链超螺旋的复制形式(图3)。这样既便于限制性内切酶在其MCS处切开,也能通过连接酶的作用把待测DNA片段接进去,构成一个重组体。     

重组DNA技术在神经科学中的应用

重组DNA技术是生物工程的主要技术,它在神经科学研究中发挥着重要的作用,形成为一个新的前沿——分子遗传神经科学。重组DNA技术主要包括四方面:(1)用限制性内切酶将DNA切割成特定的片段,(2)用核酸杂交钓出特定的DNA或RNA顺序,(3)DNA克隆和扩增,(4)DNA顺序测定,再根据三联密码推断蛋白质的氨基酸排列顺序,其速度远超过经典的蛋白质化学方法。换言之,重组DNA技术可以将特定的基因从基因库中分离开来,进     

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

DNA足纹步移作图法

一种以PCR介导的、可对任意长度靶DNA片段上的核蛋白结合位点进行DNA足纹作图分析的新方法.原理是：采用被随机降解靶DNA分子作为模板,用标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物进行单链扩增.首先,利用某种化学试剂或酶如DNaseⅠ对已与蛋白质结合或未结合的双链靶DNA进行随机降解,在一定条件下使每一个DNA分子恰好只有一个位点被切割.然后,这些被随机降解DNA分子即可作为模板,用同位素标记的跨越整个模板的足够多条特异性引物（正向或反向）进行单链扩增.最后,扩增的单链产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影形成DNA片段梯队,而被蛋白质保护的位点则在DNA片段梯队中形成位置缺口,从而确定DNA与蛋白质相结合的精确位点.该方法被应用对人干细胞因子基因5′旁侧－1190～－273区域的DNA足纹部分作图.     

DNA聚合酶Ⅰ

1957年科恩伯格(A.Kornbeng)通过测定放射性标记的[~(14)C]胸苷三磷酸参入DNA的能力,发现一种催化DNA合成的酶。这种酶现在叫做DNA聚合酶Ⅰ或Pol Ⅰ,为含有928个氨基酸残基的多肽单链。酶促反应的底物是4种脱氧核苷三磷酸。反应需要DNA模板和一小段与模板互补的多核苷酸引物。反应中,引物或生长中DNA链的3′羟基与新参入核苷酸的α-磷酸基结合。反应     

衰老过程中大白鼠脾细胞的DNA单链断裂与重接能力的变化

 DNA被紫外线损伤后,由DNA切除修复酶切除嘧啶二聚体,随之以另一条正常的DNA链为模板修复合成DNA片段,最后由DNA连接酶将新合成的DNA片与原有的DNA链连接。本文用荧光法测定DNA修复过程中DNA单链的断裂及重接能力与衰老的关系。结果表明,不同年龄大鼠脾细胞均具有修复DNA单链断裂的能力,DNA单链断裂重接的能力与年龄有相关性,断乳鼠及青年鼠的脾细胞当保温至30min时,即开始了DNA链的重接,保温90min后则恢复到原有水平;而老年鼠脾细胞保温至90min时才开始DNA链的重接,保温150min,尚未恢复到原有水平。还发现,断乳鼠及老年鼠脾细胞的单链DNA含量高于青年鼠。     

小鼠IL-27真核表达载体的构建及其在RAW264.7 细胞中的表达

目的:构建小鼠白介素27(Interleukin 27,IL-27)单链融合基因的真核表达载体并检验其在RAW264.7细胞中的表达情况。方法:提取小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR扩增出小鼠EBI3和p28 c DNA。采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3和p28基因片段,构建小鼠IL-27单链融合基因(mouse single chain IL-27,msc IL-27),并将其克隆至pc DNA3.1(+)载体。通过酶切和测序鉴定阳性重组载体,将重组质粒pc DNA3.1-IL-27通过脂质体转染法转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果:测序分析表明,小鼠IL-27单链融合基因中EBI3、linker和p28的连接顺序、方向及碱基序列与预期相符。在转染后的RAW264.7细胞中检测到了小鼠IL-27 m RNA的表达。结论:成功构建了小鼠IL-27单链融合基因及其真核表达载体,并在RAW264.7细胞中实现表达,为进一步探讨IL-27的生物学功能奠定了基础。     

快速检查寡聚DNA片段序列的方法

以质粒为模板,用待测寡聚DNA片段和通用测序引物进行PCR（聚合酶链式反应）,PCR片段经纯化后插入到pUC－18或pUC－19的多克隆位点中,然后用通用测序引物测定重组质粒上待测寡聚DNA片段,即可清晰、正确地知道它的序列．     

cosmid克隆筛选的体内同源重组法——一个含有小鼠t复合体连锁DNA顺序的cosmid克隆的分离

一个从cosmid分子克隆库中筛选特别基因顺序的遗传学方法——体内同源重组(invlvo homologous recombination)法。即使探针DNA与分子克隆库中带有与探针同源顺序的克隆发生体内重组,然后以遗传学方法进行筛选。cosmid分子克隆库构建在rec宿主细胞内,经体内包装(in vivo Packaging)成λ噬菌体颗粒,把该噬菌体颗粒转入带有探针DNA的rec~+细胞内,探针是已被克隆在与cosmid载体没有同源顺序的质粒(如PUC8或PUC9)内的。经过一段时间(1—3小时),待重组发生后,把cosmid进行体内包装。此时探针DNA连同质粒已整合入cosmid基因组内,因此它带有原为两个载体所分别带有的双重抗性——Amp~r(氨苄青霉素,PUC8或PUC9)和Kan~r(卡那霉素,cosmid)。这种双重抗性菌落可在含有这2种抗菌素的培养平皿上选出,该重组cosmid借助于λ切除酶的作用将已被整合的探针质粒重新切除,再经体内包装后,该cosmid被还原并纯化,然后可用一含有Xgal的培皿识别和选出。本文用此法以有关DNA探针从cosmid分子克隆库中分离得到含有与小鼠t复合体连锁的基因组顺序的克隆,并对该克隆作了物理图谱分析。