TGF-β1基因真核表达载体的构建及在BMSCs中的表达

目的研究真核表达载体pCDNA3.1( )-TGF-β1在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法基因克隆构建pCDNA3.1( )-TGF-β1真核表达载体,转染大鼠BMSCs,G418筛选获得稳定转染的细胞,RT-PCR、ELISA和免疫细胞化学检测其表达,MTT法检测其增殖活性.结果成功构建含TGF-β1基因的真核表达载体;RT-PCR、ELISA、免疫细胞化学证实了TGF-β1基因在BMSCs中至少可以表达一个月;MTT法提示转染TGF-β1基因可以促进BMSCs增殖.结论 pCDNA3.1( )-TGF-β1转染BMSCs可获得稳定表达.     

Sox9基因诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的:观察Sox9基因对人脂肪干细胞(ADSCs)的诱导作用.方法:分离、纯化、培养人源ADSCs,并绘制生长曲线,传代三次后的ADSCs利用脂质体转染Sox9基因,选用抗生素G418进行筛选.以空载体转染细胞作对照,分别取48h和14d转染后的细胞做Flag蛋白免疫组织化学鉴定.通过检测转染细胞中Ⅱ型胶原来确定ADSCs是否向软骨细胞分化.结果:ADSCs呈长梭形,形态与骨髓间充质干细胞相似,600μ/ml G418为最适筛选浓度.转染后第48h和14d的细胞均能表达Sox9基因融合表达的Flag蛋白.第48h和14d,转染效率分别为93%和75%.转染后14d的ADSCs表达Ⅱ型胶原,转染后48h实验组和对照组都为阴性.结论:Sox9基因能诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化.     

转化生长因子-β1对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及Slug表达的影响

目的检测转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSCs)增殖及Slug表达的影响。方法采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠BMMSCs,用免疫组织化学方法对培养第3代的细胞进行鉴定。用MTT法检测不同浓度TGF-β1对细胞增殖的影响;免疫荧光和免疫印迹法检测TGF-β1处理前后Slug的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMMSCs,免疫组织化学法检测显示CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性;低浓度TGF-β1对BMMSCs的增殖有促进作用,高浓度却抑制BMMSCs的增殖。TGF-β1处理24 h,Slug蛋白表达明显增强。结论一定浓度的TGF-β1可以促进BMMSCs的增殖,而且引起Slug蛋白增加。     

重组腺病毒介导 HGF 修饰 ADSCs 对大鼠肝损伤模型的治疗作用

摘要 目的：建立重组腺病毒介导肝细胞生长因子 HGF 促 ADSCs 定向分化肝细胞的方法,并对其参与肝损伤修复能力进行验 证, 为作为治疗肝损伤细胞来源提供参考。 方法： 采用消化培养的方法, 分离 SD 大鼠腹股沟脂肪组织 ADSCs 细胞, 连续传代 3 次 对其进行纯化培养, 利用形态学鉴定、 流式细胞术检测 ADSCs 表面标志物方法对其间充质干细胞样特征进行鉴定, 加入成脂肪 细胞诱导液观察其分化成脂肪细胞的能力; 构建腺病毒表达 HGF 载体 Adeno-HGF-EGFP, 并转染 ADSCs 细胞, 利用免疫细胞化 学染色方法检测肝细胞标志分子表达水平; 最后建立大鼠肝损伤动物型, 观察 Adeno-HGF-EGFP 转染的 ADSCs 细胞参与肝损 伤修复能力情况。结果： 分离的 ADSCs 细胞形态较为一致, 绝大多数呈梭形, 排列不规则。流式细胞术结果显示, 该细胞表达 CD29、 CD90、 CD106 等间充质干细胞细胞表面标记物, 低表达造血干细胞细胞表面标记物 CD34、 CD45, 同时, 分离的 ADSCs 细 胞具有诱导分化成脂肪细胞能力; Adeno-HGF-EGFP 转染 ADSCs 后, AFP、 ALB、 CK18 等肝细胞特异性分子表达水平升高;经尾 静脉注射 ADSCs 细胞后, 肝损伤大鼠的 AST、 ALT、 TBIL 等分子表达水平恢复正常。结论： 建立了重组腺病毒介导肝细胞生长因 子 HGF 促 ADSCs 定向分化肝细胞的方法, 并且表达 HGF 的 ADSCs 细胞具有修复大鼠肝损伤模型能力, 这为通过细胞治疗肝损 伤提供了新的细胞来源。     

重组腺病毒介导HGF修饰ADSCs对大鼠肝损伤模型的治疗作用

目的：建立重组腺病毒介导肝细胞生长因子HGF促ADSCs 定向分化肝细胞的方法,并对其参与肝损伤修复能力进行验证,为作为治疗肝损伤细胞来源提供参考。方法：采用消化培养的方法,分离SD 大鼠腹股沟脂肪组织ADSCs 细胞,连续传代3 次对其进行纯化培养,利用形态学鉴定、流式细胞术检测ADSCs 表面标志物方法对其间充质干细胞样特征进行鉴定,加入成脂肪细胞诱导液观察其分化成脂肪细胞的能力;构建腺病毒表达HGF载体Adeno-HGF-EGFP,并转染ADSCs 细胞,利用免疫细胞化学染色方法检测肝细胞标志分子表达水平;最后建立大鼠肝损伤动物模型,观察Adeno-HGF-EGFP 转染的ADSCs 细胞参与肝损伤修复能力情况。结果：分离的ADSCs 细胞形态较为一致,绝大多数呈梭形,排列不规则。流式细胞术结果显示,该细胞表达CD29、CD90、CD106 等间充质干细胞细胞表面标记物,低表达造血干细胞细胞表面标记物CD34、CD45,同时,分离的ADSCs 细胞具有诱导分化成脂肪细胞能力;Adeno-HGF-EGFP 转染ADSCs后,AFP、ALB、CK18 等肝细胞特异性分子表达水平升高;经尾静脉注射ADSCs 细胞后,肝损伤大鼠的AST、ALT、TBIL 等分子表达水平恢复正常。结论：建立了重组腺病毒介导肝细胞生长因子HGF促ADSCs定向分化肝细胞的方法,并且表达HGF的ADSCs 细胞具有修复大鼠肝损伤模型能力,这为通过细胞治疗肝损伤提供了新的细胞来源。     

鸭脂肪间充质干细胞分离培养与生物学特性

建立禽类脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外培养体系,探索其生物学特性和多分化潜能。通过酶消化法分离18日龄鸭胚ADSCs,绘制生长曲线,通过RT-PCR、免疫荧光和流式细胞术阳性率检测对ADSCs进行鉴定,诱导ADSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化。结果表明,鸭胚胎ADSCs体外增殖能力良好;阳性表达CD29,CD44,CD105,表达率分别为95.39%、94.53%和98.19%;经体外诱导后可分化为成骨细胞和脂肪细胞。研究认为在适宜的培养条件下,体外培养的ADSCs能够稳定增殖并具有多分化潜能,可作为组织工程的种子细胞进行保存。     

牛脂肪间充质干细胞的分离、培养与鉴定

为了给组织工程提供种子细胞,对牛间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)进行体外分离培养。首先应用胶原酶消化法分离牛ADSCs,进行体外培养、连续传代,并观察细胞的形态变化,通过细胞计数绘制生长曲线,细胞压片进行染色体分析,采用细胞免疫荧光化学方法检测细胞表面标记,利用成骨分化和成脂分化检测其分化能力。结果显示牛ADSCs体外培养时细胞形态呈成纤维细胞样,增殖稳定;Vimentin、CD49d、CD13表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨诱导条件下的细胞碱性磷酸酶活性高,茜素红染色呈阳性;成脂诱导条件下细胞周围脂滴明显,油红-O染色呈阳性。结果证明牛ADSCs体外生长稳定、增殖速度快、定向分化能力强,简易的体外分离培养及诱导方法为其在组织工程中的应用奠定了基础。     

体外HCN2转染脂肪干细胞构建起搏细胞的实验研究

目的:体外HCN2基因转染人脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)构建起搏细胞.方法:取人脂肪组织分离得到脂肪干细胞并进行体外培养,Ad.HCN2转染后检测HCN2表达情况,检测转染后ADSCs自主产生起搏电流(pacemaker current,If)的能力.结果:RT-PCR结果显示实验组HCN2基因表达.Western-blot可检测到实验组HCN2蛋白表达.流式细胞仪检测可见实验组HCN2阳性比例明显升高.免疫荧光检测可见转染的ADSCs发出红色荧光.膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位140mV,呈电压依赖性.结论:ADSCs被Ad.HCN2转染后可表达目的基因HCN2,并自主产生起搏电流.     

Exendin-4通过JNK和ERK信号通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖

目的:探讨Exendin-4对大鼠脂肪来源干细胞的(Adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖作用及其机制。方法:体外分离培养SD大鼠腹股沟处脂肪组织,流式细胞学方法鉴定分离的ADSCs,使用Exendin-4(Ex-4,0-50 nm/L)对P4代(第四代)ADSCs进行干预,采用MTT检测ADSCs的增殖情况,Western blot检测MAPK通路中JNK和ERK的磷酸化水平,使用相应的阻断剂来观测JNK和ERK通路对ADSCs增殖作用的影响。结果:分离培养的ADSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD34和CD45,符合间充质干细胞的表型。Ex-4以浓度依赖方式促进ADSCs体外增殖,10 nm/L为最适促增殖处理浓度。同时,Ex-4可以提高细胞中c-Jun和ERK的磷酸化水平,而给予相应阻断剂后,磷酸化蛋白表达减弱,细胞增殖能力也明显减弱。结论:Ex-4可以通过JNK和ERK通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖。     

人VEGF基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

为建立hVEGF165基因转染大鼠间充质干细胞的方法．采用密度梯度离心-贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC,并测定其生长曲线和表面标志CD34、CD44、CD45及SH3,然后向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化;用脂质体介导pcDNA3.1-hVEGF165转染BMMSC,观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过RT-PCR、Western和ELISA鉴定VEGF在细胞中的表达情况．经培养的大鼠BMMSC,CD44、SH3检测为阳性．CD45、CD34阴性,可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞;经RT-PCR、Western和ELISA检测证实阳离子脂质体能成功地将hVEGF165基因转染至大鼠BMMSC中,并获得有效的表达．真核表达栽体pcDNA3.1-hVEGF165在BMMSC中获有效表达,为VEGF基因转染BMMSC移植对心梗后大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据．     

TGF-β3与TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/壳聚糖生物支架修复兔软骨缺损(英文)

目的:TGF-β3广泛存在于骨组织、软骨组织中,能诱导体外培养的间充质干细胞向软骨分化、生长。TIMP-2能抑制MMP对软骨基质的降解,保护新生软骨组织。本实验探讨单纯TGF-β3和TGF-β3,TIMP-2联合转染兔骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白壳聚糖/(silk fibrin/chitosan,SF/CS)生物支架植入动物体内修复兔膝关节软骨缺损的可行性及效果差异。方法:将新西兰大白兔20只分为4组,每组5只(支架组、未转染组、reAAV-TGF-β3转染组、reAAV-TGF-β3,reAAV-TIMP-2联合转染组)。在无菌条件下取兔第三代对数生长期骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),用携带目的基因的重组腺相关病毒进行转染,将转染成功的BMSCs与SF-CS生物支架复合,分别植入兔膝关节软骨缺损处:未转染组植入SF-CS生物支架,未转染组植入未转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3转染组植入reAAV-TGF-β3转染的BMSCs复合SF-CS生物支架,reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染组植入reAAV-TGF-β3,TIMP-2联合转染的BMSCs复合SF-CS生物支架。两月后处死家兔,肉眼观察以及HE染色评定缺损软骨修复情况。并进行软骨细胞特征性染色即甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色鉴定。结果:两个月后除支架组外各实验组兔膝关节软骨缺损处均有软骨样物质形成,且联合转染组诱导的新生成分更接近缺损处周围正常软骨。联合转染组与reAAV-TGF-β3转染组;联合转染组与未转染组;reAAV-TGF-β3转染组与未转染组的评分差异均具有统计学意义(P0.05)。HE染色结果提示联合转染组软骨修复效果较单纯TGF-β3转染组更好。结论:单纯TGF-β3转染兔骨髓间充质干细胞对兔膝关节软骨缺损有修复作用,TGF-β3与TIMP-2联合转染组修复缺损效果更明显,提示TIMP-2与TGF-β3具有协同效应。     

foxp3转染的CD4~+ CD25~- T细胞治疗急性肺损伤的研究

目的通过基因转染技术将foxp3基因导入CD4+CD25-T淋巴细胞,生成CD4+CD25-Foxp3+T细胞,通过输入急性肺损伤小鼠模型体内,促进炎症消退,为体外定向操纵调节T细胞生成和细胞过继治疗急性肺损伤奠定基础。方法采用RT-PCR法从小鼠胸腺来源cDNA文库中扩增获得foxp3 cDNA,亚克隆至构建pIRES2-EGFP质粒中,构建并筛选出重组质粒pmFoxp3-IRES2-EGFP;采用免疫磁珠法分离CD4+CD25-T淋巴细胞,穿孔法转染Foxp3基因至CD4+CD25-T淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4+和EGFP共表达的细胞比例;将foxp3基因转染的小鼠CD4+CD25-T细胞通过尾静脉输注急性小鼠体内,通过ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中TNF-α以及IL-1β细胞因子的表达,通过肺组织病理研究肺部炎症的消退状况。结果成功构建双基因共表达重组质粒pmFoxp3-IRES2-EGFP;免疫磁珠法较高纯度分离CD4+CD25+、CD4+CD25-T淋巴细胞,电穿孔法成功将重组质粒pmFoxp3-IRES2-EGFP转染致CD4+CD25-T细胞,CD4+和EGFP共表达的细胞比例为35.5%;过继Foxp3基因转染的小鼠CD4+CD25-T细胞以及Treg均能抑制急性肺损伤小鼠肺泡灌洗液中TNF-α以及IL-1β炎性细胞因子的表达,促进炎症的消退。结论转染Foxp3基因的CD4+CD25-细胞同Treg(CD4+CD25-)细胞一样可以通过细胞过继治疗急性肺损伤。     

Nurr-1基因转染促进脂肪干细胞的神经分化

目的:研究孤儿核受体相关基因1(Nurr-1)对脂肪干细胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神经元方向分化的潜在作用。方法:流式细胞术与成骨、成脂诱导技术鉴定脂肪干细胞;Nurrr-1基因转染脂肪干细胞后,应用神经特异性标志物MAP-2,β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力。结果:流式细胞术结果表明培养的细胞CD29,CD44表达90%以上,CD45,CD90表达均低于1.5%,经过诱导后,油红O、茜素红S染色均呈阳性,表明所培养的细胞为脂肪干细胞;慢病毒转染Nurr-1基因后,免疫荧光染色检测MAP-2,β-tubulin的免疫荧光强度显著增加;RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞的MAP-2、β-tubulin、NF200的表达量显著提高。结论:Nurr-1基因转染能促进脂肪干细胞向神经方向分化,为神经损伤和神经退行性病变的治疗提供了新途径。     

microRNA-21靶向PDCD4/PTEN对大鼠ADSCs凋亡的抑制作用

该研究探究miR-21对大鼠ADSCs凋亡的影响,为提高ADSCs移植存活率提供依据。该研究建立大鼠ADSCs体外凋亡模型,采用qRT-PCR检测miR-21的表达。在ADSCs中采用Lipofectamine 2000转染miR-21 mimics,qRT-PCR检测miR-21 mimics转染效率。CCK-8、Hoechst 33258检测大鼠ADSCs过表达miR-21对细胞存活率的影响;Western blot检测大鼠ADSCs过表达miR-21后凋亡相关蛋白表达量。结果显示H_2O_2诱导细胞凋亡后,miR-21在ADSCs中的表达明显下调。大鼠ADSCs转染miR-21 mimics后,ADSCs中miR-21的表达量较对照组显著提高了7.4倍。与miR-21 scramble组相比,ADSCs过表达miR-21后,ADSCs存活率显著升高,促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达量显著降低,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显升高。与对照组相比,miR-21过表达后,PDCD4和PTEN mRNA无显著变化,但PDCD4和PTEN蛋白表达明显下调。利用PDCD4 siRNA和Phen阻断PDCD4和PTEN的表达后,Caspase-3、Bax的表达水平显著降低,Bcl-2的表达水平显著升高。该研究得出miR-21通过靶向PDCD4/PTEN增强大鼠ADSCs对凋亡的抑制作用。     

Snail基因修饰对骨髓基质干细胞骨架结构稳定作用及促迁移和对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究

转录因子Snail是调控肿瘤细胞迁徙转移的重要调控分子,基于干细胞与肿瘤细胞分子机制的重叠性,提出通过借鉴肿瘤细胞迁移的相关机制以用于提高骨髓基质干细胞向缺氧受损组织迁移能力的假设和研究思路,探讨Snail基因在人骨髓基质干细胞（MSCs）中的转染和表达情况,及转染后对基质干细胞促迁移作用、骨架结构的稳定作用及对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用。密度梯度离心法及细胞体外培养分离纯化人骨髓MSCs,脂质体法将重组表达载体pCAGGSneo-Snail-HA转染MSCs,G418筛选稳定表达,流式细胞仪检测MSCs表面抗原,采用免疫荧光染色技术检测转染后MSCs报告基因HA及目的基因Snail表达,Transwell细胞迁移实验和Western-blot评估细胞迁移能力和检测有关细胞信号转导通路分子水平变化,荧光染色分析细胞骨架,Sub-G₁凋亡峰流式细胞仪检测细胞凋亡率并评估细胞抗凋亡能力。经流式细胞仪选择检测分离纯化扩增MSCs表面分子特点为CD34(-)/CD29(+),Snail及报告基因在转染后MSCs呈阳性表达,Snail质粒转染MSCs(MSCs-Sna)较对照空质粒转染MSCs(MSCs-neo)细胞迁移率增加(P<0.05),PI-3K信号通路特异性抑制剂Wortmannin能显著抑制此迁移率的增加,无血清培养72h后,MSCs-Sna凋亡率较MSCs-neo低(P<0.05)。经Snail基因转染,MSCs迁移能力、骨架结构的稳定性及在无血清培养环境中抗凋亡能力增加。     

转化生长因子-β1通过促进结缔组织生长因子表达抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖

目的:研究转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对人胰腺癌细胞系PANC-1增殖的影响。方法:首先利用MTT检测重组TGF-β1、CTGF及anti-CTGF抗体处理PANC-1细胞后,细胞的增殖状态,用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)检测转染pcDNA3.1(-)-CTGF后PANC-1细胞的凋亡情况,最后利用RT-PCR检测TGF-β1作用PANC-1细胞后CTGF mRNA的表达。结果:TGF-β1和CTGF均呈浓度依赖性抑制PANC-1细胞增殖,加入anti-CTGF抗体可以取消TGF-β1对PANC-1细胞增殖的抑制作用;FCM结果显示pcDNA3.1(-)-CTGF质粒转染促进PANC-1细胞凋亡;RT-PCR则证明TGF-β1促进PANC-1细胞中CTGF mRNA表达。结论:TGF-β1可能通过促进CTGF表达来发挥抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖的作用。     

SPARC基因过表达对SKM-1细胞凋亡的影响

构建SPARc基因过表达载体,转染人骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）-u／胞系SKM-1细胞,探讨SPARc基因过表达对!＆MDS细胞系SKM一1细胞凋亡的影响。XpcD—NA．SPARC为引物,PCR扩增SPARc基因;将靶基因克隆入慢病毒载体pGC—GV,构建含有删Rc基因的重组慢病毒载体pGC—GV-SPARC,测序检测正确性;将构建载体pGC-GV-5黝尺C砗专染人MDs细胞系SKM-1,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR检测sKM-1细胞中SPARCmRNA表达,Westernblot检测SPARC蛋白表达,MTS法测定小剂量阿糖胞苷（30ng／mL）对实验组增殖抑制的影响,AnnexinV检测．洲尺c基因转染后对人SKM-1细胞凋亡的影响。结果显示,构建含有SPARc基因的重组慢病毒载体pGC-GV-SPARC转染效率为（64．25±1．42）％;转染后,SPARCmRNA及蛋白表达在靶细胞中较对照组增多。小剂量阿糖胞苷对转染组的增殖抑制率明显高于其他组。SPARC基因转染后人SKM-1细胞凋亡率较未转染组明显增高,加入阿糖胞苷后人SKM-1细胞凋亡率较对照组明显增高。由此说明,作者成功构建了携带．＆SPARc基因的慢病毒载体,转染．NSKM-1细胞系后稳定表达SPARC基因,SPARC过表达可抑制细胞增殖,且联合小剂量阿糖胞苷（30ng／mL）更有效地抑制SKM-1细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

人β防御素-2通过TGF-β/Smad信号通路对胃癌SGC7901细胞增殖、迁移和侵袭的影响

该文探讨了人β防御素-2(hBD2)对胃癌SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。将真核表达载体pCMV-hBD2转染于人胃癌SGC7901细胞。采用qPCR和免疫印迹法(Western blot)检测转染效率。Western blot检测TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、MMP9的蛋白表达水平。Transwell法检测SGC7901细胞迁移和侵袭能力。EdU法和流式细胞术分别检测增殖能力与细胞周期。结果显示,转染真核表达载体pCMV-hBD2的SGC7901细胞, hBD2的表达水平明显高于SGC7901和转染pCMV-Blank的SGC7901细胞。SGC7901-hBD2细胞中TGF-β1、p-Smad2/3和MMP9的蛋白表达水平均低于SGC7901和SGC7901-Blank细胞,而Smad2/3表达水平不变。同时,其迁移侵袭和增殖能力均受到抑制,细胞周期G0/G1期阻滞。该实验结果表明, hBD2可能通过下调TGF-β/Smad信号通路调控SGC7901细胞的迁移侵袭以及增殖能力。     

Snail基因修饰对骨髓基质干细胞骨架结构稳定作用及促迁移和对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用研究

转录因子Snail是调控肿瘤细胞迁徙转移的重要调控分子,基于干细胞与肿瘤细胞分子机制的重叠性,提出通过借鉴肿瘤细胞迁移的相关机制以用于提高骨髓基质干细胞向缺氧受损组织迁移能力的假设和研究思路,探讨Snail基因在人骨髓基质干细胞(MSCs)中的转染和表达情况,及转染后对基质干细胞促迁移作用、骨架结构的稳定作用及对无血清培养诱导细胞凋亡的保护作用。密度梯度离心法及细胞体外培养分离纯化人骨髓MSCs,脂质体法将重组表达载体pCAGGSneo-Snail-HA转染MSCs,G418筛选稳定表达,流式细胞仪检测MSCs表面抗原,采用免疫荧光染色技术检测转染后MSCs报告基因HA及目的基因Snail表达,Transwell细胞迁移实验和Western-blot评估细胞迁移能力和检测有关细胞信号转导通路分子水平变化,荧光染色分析细胞骨架,Sub-G1凋亡峰流式细胞仪检测细胞凋亡率并评估细胞抗凋亡能力。经流式细胞仪选择检测分离纯化扩增MSCs表面分子特点为CD34(-)/CD29( ),Snail及报告基因在转染后MSCs呈阳性表达,Snail质粒转染MSCs(MSCs-Sna)较对照空质粒转染MSCs(MSCs-neo)细胞迁移率增加(P<0.05),PI-3K信号通路特异性抑制剂Wortmannin能显著抑制此迁移率的增加,无血清培养72h后,MSCs-Sna凋亡率较MSCs-neo低(P<0.05)。经Snail基因转染,MSCs迁移能力、骨架结构的稳定性及在无血清培养环境中抗凋亡能力增加。     

慢病毒介导的GFP转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、细胞表型及脑脊液诱导后分化能力的影响

摘要 目的：研究慢病毒（Lentivirus）介导的绿色荧光蛋白（Lentivirus-GFP）转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的可行性及稳定性,以及对人脑脊液诱导转染后BMSCs（BMSCs-GFP）成神经分化能力的影响。方法：全骨髓贴壁法培养BMSCs,Lentivirus-GFP以5、10、30、50的感染复数（MOI）转染BMSCs,96h后倒置显微镜下观察GFP转染效率和表达情况,筛选最适MOI;流式细胞术检测细胞表型;CCK8法检测细胞活力。人脑脊液诱导BMSCs-GFP向神经细胞分化,蛋白印迹法检测神经细胞表面标记物MAP-2和Nestin表达。结果：全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs生长旺盛。MOI值为5、10、30、50的转染效率分别为56.2%、87.3%、94.7%和95.1%,当MOI为30时,Lentivirus-GFP转染BMSCs效率较高,且对BMSCs生长状态无显著性影响。BMSCs-GFP表达CD29、CD90,较少表达CD45、CD54,符合干细胞特性。BMSCs-GFP增殖活性与未转染GFP基因的BMSCs相比,差异无统计学意义（P>0.05）。人脑脊液诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化后表达神经元标记物MAP-2和Nestin。结论：Lentivirus-GFP能高效稳定转染大鼠BMSCs（最适MOI值为30）,同时不影响其生物学特性,人脑脊液能诱导BMSCs-GFP成神经细胞分化。