萘醌-氧吲哚生物碱coprisidins生物合成途径的研究（英文）

【目的】新颖结构的天然萘醌-氧吲哚类生物碱coprisidins(A和B)分离自昆虫肠道相关链霉菌,具有预防癌症的活性。作为首例具有萘醌-氧吲哚骨架的生物碱,对其独特生物合成机理的研究可为Ⅱ型聚酮类化合物生物合成途径提供新的认知。【方法】本研究对coprisidins的产生菌Streptomycessp.SNU607进行全基因组测序,并根据测序结果的生物信息学分析初步定位coprisidins的生物合成基因簇;通过基因敲除以及异源表达手段确定coprisidins的生物合成基因簇;基于体内遗传学实验与生物信息学分析初步推导coprisidins的生物合成途径。【结果】Streptomyces sp. SNU607中有23个基因簇可能参与次级代谢,其中4个基因簇与聚酮合酶(PKS)相关;通过基因敲除与异源表达实验,本研究证实1个Ⅱ型PKS负责coprisidins的生物合成;基于生物信息学分析,我们推测copH/I/M/O/N构成了1个基因盒,并负责起始单元丁酰CoA的合成;KSβ(Cop B)的序列比对表明coprisidins的Ⅱ型PKS系统更倾向于合成C20的初始聚酮链。【结论】Coprisidins的萘醌-吲哚结构是由Ⅱ型PKSs催化形成,我们推测丁酰Co A是coprisidins聚酮骨架的起始单元,在最小PKS、聚酮酶、环化酶的催化下先形成类似蒽环的四环系统,随后在后修饰酶与氧化重排的作用下生成萘醌-氧吲哚骨架。本研究为进一步探究萘醌-氧吲哚类生物碱的生物合成机制奠定了基础,同时增加了Ⅱ型PKSs合成产物的结构多样性。     

除虫链霉菌10个聚酮类抗生素生物合成基因簇的敲除对阿维菌素产量的影响

【目的】考察除虫链霉菌基因组中其它聚酮合成酶类(Polyketide synthase,PKS)抗生素生物合成基因簇的敲除突变对于阿维菌素产量的影响。【方法】构建了11个PKS基因簇的打靶Cosmid和质粒载体,导入除虫链霉菌中筛选突变株。【结果】在工业菌株MMR630中成功敲除了10个PKS基因簇。发酵结果显示7个PKS基因簇敲除突变株中阿维菌素的产量均有不同程度的提高,而2个突变株不能产生阿维菌素。然而,在3个连续敲除2个PKS基因簇的突变株中阿维菌素产量没有能够超过单个PKS敲除突变株的提升幅度。【结论】除虫链霉菌基因组的一些PKS基因簇的敲除可以提高阿维菌素的产量,同时暗示同一类次生代谢产物的代谢流之间存在复杂的相互作用关系。     

大肠杆菌甲基转移酶dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响

【目的】大肠杆菌的dcm基因编码的DNA甲基转移酶可以特异性地将5′CCWGG3′(W=A/T)序列中第二个胞嘧啶变成5-甲基胞嘧啶。Dcm甲基转移酶发现已有37年了,但其确切的功能不明,本篇主要研究其对变铅青链霉菌的影响。【方法】通过构建克隆、接合转移、异源表达及HPLC、酶切、Southern杂交等方法研究dcm基因的表达对变铅青链霉菌的多效性影响。【结果】首次发现变铅青链霉菌基因组中不含5-甲基胞嘧啶修饰,将dcm基因导入变铅青链霉菌后,接合子菌落比正常菌落小很多,并有放线紫红素产生。【结论】基因组的表观遗传修饰能激活沉默放线紫红素基因簇的表达这一现象,为基因组挖掘隐藏的活性天然产物提供了一条新途径。     

terC基因对天蓝色链霉菌抗生素合成和菌丝体生长的影响

【目的】研究天蓝色链霉菌中terC (SCO2366)基因的功能。【方法】通过敲除天蓝色链霉菌中terC基因,检测其对放线紫红素合成和菌丝体生长的影响。【结果】敲除天蓝色链霉菌中的terC基因后,放线紫红素提前合成,同时菌丝体长度变短。【结论】terC在天蓝色链霉菌中对放线紫红素的合成有负调控作用,同时影响菌丝体生长发育。     

黄曲霉分生孢子色素合成基因pks1的鉴定及其对生长发育和侵染性的影响

【目的】分生孢子色素是真菌细胞壁的重要成分,对真菌的生长发育极为重要,并有助于真菌抵御各种环境胁迫。本研究鉴定了黄曲霉分生孢子色素合成基因,并研究了分生孢子色素对黄曲霉生长发育及其对抗紫外照射和侵染能力的影响。【方法】通过已知真菌孢子色素合成基因蛋白序列同源比对确定了黄曲霉分生孢子色素合成基因及其所在的基因簇,利用同源重组策略对目标基因进行敲除,获得了该色素合成基因缺失的突变菌株,并研究该基因敲除后对表型、产孢、菌核形成、黄曲霉毒素产生、抗紫外照射和侵染性等影响。【结果】与野生型菌株相比,黄曲霉pks1基因缺失菌株的分生孢子颜色变为白色,生长速度、孢子产量、菌核形成和黄曲霉毒素B_1的产生均没有显著性变化,但该基因的缺失导致孢子对紫外线照射的抵御能力明显减弱,降低了黄曲霉对玉米和花生种子的侵染能力。【结论】pks1(AFLA_006170)基因是黄曲霉分生孢子色素合成的关键基因,影响黄曲霉分生孢子对紫外线照射等不利环境因子的抵抗能力和对粮食种子的侵染能力。     

萘醌-氧吲哚生物碱coprisidins生物合成途径的研究

[目的] 新颖结构的天然萘醌-氧吲哚类生物碱coprisidins（A和B）分离自昆虫肠道相关链霉菌,具有预防癌症的活性。作为首例具有萘醌-氧吲哚骨架的生物碱,对其独特生物合成机理的研究可为II型聚酮类化合物生物合成途径提供新的认知。[方法] 本研究对coprisidins的产生菌Streptomyces sp.SNU607进行全基因组测序,并根据测序结果的生物信息学分析初步定位coprisidins的生物合成基因簇;通过基因敲除以及异源表达手段确定coprisidins的生物合成基因簇;基于体内遗传学实验与生物信息学分析初步推导coprisidins的生物合成途径。[结果] Streptomyces sp.SNU607中有23个基因簇可能参与次级代谢,其中4个基因簇与聚酮合酶（PKS）相关;通过基因敲除与异源表达实验,本研究证实1个II型PKS负责coprisidins的生物合成;基于生物信息学分析,我们推测copH/I/M/O/N构成了1个基因盒,并负责起始单元丁酰CoA的合成;KS_β（CopB）的序列比对表明coprisidins的II型PKS系统更倾向于合成C20的初始聚酮链。[结论] Coprisidins的萘醌-吲哚结构是由II型PKSs催化形成,我们推测丁酰CoA是coprisidins聚酮骨架的起始单元,在最小PKS、聚酮酶、环化酶的催化下先形成类似蒽环的四环系统,随后在后修饰酶与氧化重排的作用下生成萘醌-氧吲哚骨架。本研究为进一步探究萘醌-氧吲哚类生物碱的生物合成机制奠定了基础,同时增加了II型PKSs合成产物的结构多样性。     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

谷氏菌素生物合成基因gouC和gouD的功能研究北大核心CSCD

【目的】由于谷氏菌素产生菌禾粟链霉菌的遗传操作效率较低,本研究在谷氏菌素生物合成基因簇成功异源表达的基础上,通过在异源宿主天蓝色链霉菌M1146中阻断谷氏菌素生物合成基因gouC和gouD,研究其在谷氏菌素生物合成中的作用,为谷氏菌素生物合成途径的阐明奠定基础。【方法】以含有谷氏菌素生物合成基因簇的黏粒D6-4H为基础,通过PCR-targeting的方法分别将gouC和gouD敲除得到重组质粒p GOUe-ΔC和p GOUe-ΔD。通过接合转移将这两个重组质粒分别导入天蓝色链霉菌M1146中,获得gouC和gouD的缺失突变株M1146-GOUe-ΔC和M1146-GOUe-ΔD,通过HPLC分析突变株的谷氏菌素中间产物积累情况,分离纯化后对其进行结构鉴定和生物活性检测。【结果】gouC和gouD的缺失均导致谷氏菌素不能合成,突变株发酵液中积累了不同的中间产物,生物活性分析发现这些中间产物均失去了对肿瘤细胞的抑制活性。【结论】gouC和gouD是谷氏菌素生物合成的重要基因,与谷氏菌素肽基部分的肌氨酸残基合成相关。本研究为阐明谷氏菌素的生物合成机制提供了更多的依据。     

一个甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成途径中的功能

【目的】洛蒙真菌素是在洛蒙德链霉菌(Streptomyces lomondensis)中生物合成的一种具有广谱抑菌活性的吩嗪类抗生素,但其合成机理仍不清晰。在洛蒙德链霉菌S015的洛蒙真菌素生物合成核心基因簇下游,有一甲基转移酶基因——lomo3,研究该基因对洛蒙真菌素生物合成的影响。【方法】对lomo3基因进行无痕敲除得到基因缺失突变株S015Δlomo3,再过表达重组质粒构建回补突变株S015Δlomo3::lomo3,比较两株突变株与野生型S015的发酵产物的变化。【结果】发现基因缺失菌株S015Δlomo3不能合成洛蒙真菌素,而基因回补菌株S015Δlomo3::lomo3则可恢复洛蒙真菌素的合成能力。【结论】甲基转移酶基因lomo3在洛蒙真菌素生物合成过程中起着重要的作用,但该基因的具体功能还有待深入研究。研究对于阐明洛蒙真菌素的生物合成途径具有一定的指导作用。     

天蓝色链霉菌孢子色素whiE在大肠杆菌中的异源生物合成

【目的】在大肠杆菌中完整重构孢子色素whiE的生物合成途径,分离纯化表达体系中合成的新化合物,并解析whiE的生物合成途径。【方法】构建whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI的单基因重组质粒,SDS-PAGE检测蛋白表达情况;借助Xba I与Spe I互为同尾酶的特性,实现多基因组合串联;构建好的重组质粒再导入大肠杆菌菌株BAP1中进行异源表达,并用高效液相色谱(HPLC)检测发酵产物;依次使用正相硅胶柱和反向半制备柱分离发酵产物,四级杆飞行时间质谱仪(Q-TOFMS)鉴定发酵产物分子量。【结果】whiE-ORFII、whiE-ORFVII和whiE-ORFI均获得可溶性表达;这3个基因单个串联到菌株BTw95中均未检测到新的产物生成;而whiE-ORFII和whiE-ORFVII、 whiE-ORFI和whiE-ORFVII双基因组合以及三基因组合串联到BTw95中可检测得到两种化合物ZYC-1和ZYC-2。在负离子模式下进行Q-TOFMS检测,ZYC-1的[M-H]-为419.0748,推测分子式为C_(23)H_(16)O_8;ZYC-2的[M-H]-为465.0743,推测分子式为C_(24)H_(18)O_(10)。【结论】本研究推进了孢子色素whiE生物合成途径在大肠杆菌中的异源重构,分离鉴定了2个十二酮II型聚酮化合物,并推测了孢子色素whiE的生物合成途径。