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在已建立的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)筛选系统的基础上,对这一系统进行了改进并对改进的系统进行了验证。将小鼠11天胚胎cDNA文库插入改进后的筛选载体的多克隆位点,转化酵母宿主菌。然后将约10^4个酵母克隆接种于选择性平板上进行筛选,得到了22个可在选择性培养基上生长的克隆。分析了其中18个克隆的DNA序列,见到13个克隆含有以正确读框融合的编码NL 相似文献
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重组α—乙酰乳酸脱羧酶的表达及部分酶学特性 总被引:2,自引:0,他引:2
用聚合酶链式反应方法以短芽胞杆菌基因组DNA为模板,克隆出0.97kb的DNA片段,经DNA测序证明α-乙酰乳酸脱羧酶基因。将该基因重组到质pBV220中,构建了重组表达质粒pBVYI,转化大肠杆菌DH5α后,经筛选得到了能表达0633-ALDC活性的转化子细胞。 相似文献
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t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
应用PCR方法,在t-PA cDNA5'端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTE-Y,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选t-PA cDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDS-PAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定t-PA的活性。Mut^s表型菌表 相似文献
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本文介绍了一种从酵母转化子中分离、检测重组质粒的有效方法。从小量酵母培养物提取的DNA可有效地转化大肠杆菌,转化效率大约为3.7×105转化子/ugDNA 相似文献
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黑曲霉(Aspergillus niger)启动子的克隆及其序列特征 总被引:2,自引:0,他引:2
应用启动子筛选载体(Promoter-trapvector)PLX2A构建了1个黑曲霉(Aspergillusniger)基因组文库,这个载体含有1个潮霉素B(Hy)磷酸转移酶编码基因(hph)它能以启动子活性选择DNA片段,用这个基因组文库转化大肠杆菌,获得了80000转化子菌落,其中94%含有插入片段,用这个基因库的质粒DNA转化黑曲霉,产生了53个抗潮霉素B(Hy^R)菌落,21个转化子的S 相似文献
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产气肠杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性?… 总被引:3,自引:0,他引:3
用PCR方法从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆出0.9kb的DNA片段,经DNA测序证明是α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,α-ALDC)基因。将α-ALDC基因重组到质粒,pBV220后,转化大肠杆菌,经筛选获得的高效表达的重组子菌株。 相似文献
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t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
应用PCR方法,在tPAcDNA5′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9重组,构建表达质粒pSTEY,利用LiCl转化法转化酵母菌YS108,在MM和MD平板上筛选表型,PCR筛选tPAcDNA与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用SDSPAGE证明表达产物的分子量为6kDa左右,用酪蛋白板溶圈法测定tPA的活性。Muts表型菌表达产物活性最高为2500IU/ml,Westernblot证实表达产物具有天然tPA分子的免疫原性。 相似文献
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具有真细菌基因启动子活性的盐生盐杆菌质粒DNA片段 总被引:4,自引:1,他引:4
利用大肠杆菌启动子探测质粒pKK232-8为载体、用两组限制性内切酶BamHI-SalI和HindⅢ-SalI分别消化盐生盐杆菌J7(Halobacteriumhalobium)的质粒pHH205,在体外进行重组,转化E.coliHB101感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择平板上筛选转化子,并从随机挑选的20株转化子中,获得抗氯霉素水平达到110μg/ml的转化子T1和T2,所含重组质粒分别被命名为pJH和pJB。经限制性酶切分析及杂交分析表明,pJH质粒上插入了一段来源于pHH205质粒的DNA片段,其大小为800bp左右。通过重新转化实验进一步表明,该DNA片段在大肠杆菌中具有启动子功能,从而证明,在古细菌(盐生盐杆菌)的质粒DNA中存在具有真细菌(大肠杆菌)基因启动子活性的DNA片段。 相似文献
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丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究 总被引:21,自引:1,他引:21
用PCR 方法从丙型肝炎病毒(HCV) cDNA 文库中克隆了两段DNA 片段,即HCV 基因组非结构NS3区抗原基因(约0.7 kb)和核心抗原C区抗原基因(约0.6 kb)的cDNA 片段。在两段cDNA 间加入连接肽Ser- Pro- Gly- Ser 的密码子序列,构建成融合抗原基因NS3- C。将该融合基因与衣藻叶绿体基因atpA 的启动子和rbcL 基因的3′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因NS3- C表达盒,再将该表达盒与选择标记基因aadA 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的PCR 和Southern 杂交分析表明,融合抗原基因NS3- C已整合到衣藻叶绿体基因组中。 相似文献
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本文介绍一种从重组质粒中快速提纯DNA插入片段的方法。质粒DNA的制备简单、快速、分离的质粒DNA可用于限制性酶切和转化大肠杆菌等。从琼脂糖凝胶中提纯DNA插入片段的方法操作简单,回收效率高,提纯的DNA片段可用于连接和制备杂交探针等。 相似文献
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我们应用以义技术,结合Lipofectin导入和GPT筛选方法,研究了DNA聚合酶ε在HeLa细胞DNA复制过程中的功能,针对DNA聚合酶ε和α的反义寡核苷酸都能够专一地抑制HeLa细胞的DNA合成。首镒直接证明了DNA聚合酶ε在哺乳动物细胞的DNA复制过程中具有重要作用。. 相似文献
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利用含红霉素抗生基因和缺启动子-信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒pGPB14为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子-信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体DNA经Sau3A酶解后与BanHI酶切的质粒pGPB14连接,转化大肠杆菌C600,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的DNA片段在0.27-1.5kb之间。用Sanger 相似文献
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以人成骨肉瘤细胞株HOS-8603为热休克模型,在利用DDmRNA方法筛选和克隆了一个热休克后表达受抑基因的cDNA片段的基础上,以该片段为探针,筛选HOS-8603细胞的cDNA文库,获得该基因的全长cDNA克隆(HSSG-1);DNA序列测定表明该cDNA全长1456bp,编码276个氨基酸,经计算机辅助分析,该cDNA序列尚未被报道。经RNA斑点杂交证实,该基因的表达于多种组织细胞之中,并且 相似文献
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抑瘤素M cDNA的克隆及表达研究 总被引:1,自引:0,他引:1
抑瘤素M是一种我功能的细胞生长调节因子,从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的CDNA;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑瘤素M的CDNA克隆到质粒PBV220后再转化DH5α进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5%,经过初步纯化的OSM能明显抑制A 相似文献
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农杆菌转化获得转B.t.基因水稻及其生物学鉴定 总被引:8,自引:0,他引:8
以水稻主栽品种“秀水11”和“春江11”预培养4d未成熟胚为转化受体,经农杆菌LBA4404/pGBI4A2B(含B.t.基因)感染后,筛选出抗性愈伤组织并获得转化植株。其中抗性愈伤组织产生频率达44% ̄70%,转化植株产生频率达27% ̄64%。转基因植物总DNA经PCR和Southern blot分子杂交试验表明,T-DNA上的外源基因已整合到水稻的基因组里。对转B.t.基因水稻植株进行了两种水 相似文献
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太湖新银鱼线粒体DNA的制备 总被引:2,自引:0,他引:2
建立了适合太湖新银鱼等小型鱼类mtDNA分离纯化的有效方法。改进匀浆条件,采用DNaseI和RNase纯化方法,可用常规方法由小量太湖新银鱼中制备出mtDNA。采用改进的碱裂解法,能够在2小时内由单尾太湖新银鱼中快速分离纯化出适于限制性分析用的mtDNA。 相似文献
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杂交测序——DNA测序新策略 总被引:2,自引:0,他引:2
杂交测序──DNA测序新策略陈尚武,马涧泉(中山医科大学生化教研室,广州510089)关键词DNA,测序,杂交人类基因组计划要求改进DNA测序方法,促进了测序技术的发展,一种全新的测序方法──杂交测序(sequencingbyhybridizatio... 相似文献