微量元素铬载体酵母摇瓶发酵研究

实验选择了啤酒酵母 2 0 16菌株为铬载体酵母生产菌株 ,通过摇瓶发酵实验 ,对三氯化铬的添加工艺进行了研究探索。确定了铬酵母发酵培养的适宜加铬条件 :在发酵开始的8h内分批流加三氯化铬 ,总加入量为 5× 10⁴mol/L ,经过 12h摇瓶发酵可得铬酵母的生物量为 1 5 5 g/ 10 0mL ,酵母含铬量为 1,10 0 μg/ g以上 ,酵母细胞对铬离子利用效率是 6 0 %以上。     

酵母富集微量元素铁的研究

目的：利用酵母细胞将无机态微量元素铁转化为有机态微量元素铁。方法：采用富集培养方法,从22株酵母菌中筛选出1株能够富集高含量铁的菌株,并测定其铁含量,同时对酵母菌最适生长条件,铁盐的筛选和硫酸亚铁添加浓度进行研究。结果：铁含量达6～8mg/g,适宜的铁盐为硫酸亚铁,其添加的离子浓度为60～120mg/kg,最适培养温度和pH分为28℃和5.5。结论：在上述优化条件下,酵母细胞富集铁能力最强。     

乳酸克鲁维酵母高拷贝整合载体的构建及应用

用酿酒酵母２６ｓ ｒＤＮＡ作探针克隆乳酸克鲁维酵母Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ２．２ｋｂ ｒＤＮＡ片段,对其作限制内切酶图谱分析。以该基因片段为同源整合的靶顺序,酿酒酵 ＵＲＡ３基因为选择标记构载体质粒ｐＩＲＫ并对其在宿主Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＭＷ９８－８ｃ细胞中的整合位点,拷数及稳定性进行测定和分析。     

陶瓷载体固定化酵母发酵动力学研究

固定化细胞和固定化酶一样,作为固液两相的非均相催化反应系统,其反应速度无疑受到内外扩散的影响。世界各国的化学工程学者在固定化酶反应动力学方面研究得较多,固定化细胞反应动力学研究虽有些报道,但主要集中在以海藻酸钙为载体的固定化系统,且载体形状为球形颗粒。对于其他材料的不同形状颗粒载体的固定化细胞动力学研究报道较少。陶瓷作为固定化细胞载体是我们研究的一种固定化细胞的新型载体,在机械强度,孔径大小,细胞与之结合牢固度及其稳定活性,再生性能方面有其特有的优越性^[10]。为了给在生产实践中使用这种新型载体提供理论依据,本文采用球型陶瓷和拉西环陶瓷为载体固定化酵母,对它们的发酵动力学进行了比较研究。     

低温辐射聚合用于酵母细胞固定化的高分子载体的研究

本文报导了一种新的用于酵母细胞固定化的高分子载体,该载体是用亲水／疏水性单体在－７８℃辐射聚合而成,讨论交联剂,乳化剂,增韧剂和致孔剂的加入对载体的制备以及载体固定化细胞的雪酵醇量的影响,同时对固定化细胞的重复反应性做了研究。     

胞红蛋白酵母双杂交载体的构建与表达

胞红蛋白（CGB）是一种新发现的分布于胞浆与胞核的携氧珠蛋白。为探讨CGB在体内的相互作用蛋白,从而促进对其分子调控网络的认识,根据CGB基因的开放阅读框架设计并合成PCR引物,从人胎肝cDNA文库中扩增得到该基因编码区.测序分析正确后将其定向克隆到酵母表达载体pGBKT7中,构建获得CGB的酵母表达载体pGBKT7-CGB,并在酵母菌AH109中表达。提取酵母总蛋白并利用标签蛋白（myc）的抗体进行免疫印迹检测。结果表明所构建的CGB酵母表达载体能够在酵母中高效表达,可用于后续的酵母双杂交文库的筛选工作。     

利用套叠PCR技术改造酵母表达载体pAO815的研究

利用套垒PCR技术将α-factor信号肽基因插入pA0815之EcoRⅠ位点,构建成分泌型表达载体pA0815α-A。在不改变原克隆位点EcoRⅠ的条件下,借助pA0815之第873位的HindⅢ位点,将pA0815AOX1启动子873-940片段连同α-factor信号肽基因序列（246bp）插入pA0815之HindⅢ/EcoRⅠ之间,构建成含α-factor信号肽基因的分泌型表达载体pA0815α-A。     

苦瓜MAP30基因的毕赤酵母表达载体构建及重组菌株的筛选

目的:从苦瓜中克隆MAP30全长基因,并将该基因连接至表达载体pPIC9中,建立酵母菌落PCR筛选方法。方法采用改良SDS法从苦瓜表皮中提取基因组DNA,设计特异性的引物,通过PCR技术扩增出全长861bp的MAP30基因。该基因经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,连接至毕赤酵母表达载体pPIC9中。重组载体转化GS115菌株,运用菌落PCR鉴定重组菌株。结果:基因测序表明,该基因已成功插入酵母表达载体pPIC9α-factor分泌信号下游,同源性分析表明该基因与GeneBank(AF284811)的核苷酸同源性达99.9%,氨基酸同源性达100%。菌落PCR显示外源基因已整合入酵母GS115菌株中。结论:成功地克隆了MAP30全长基因,并构建了含MAP30基因的重组毕赤酵母表达载体,并获得了整合菌株,为下一步研究奠定了基础。     

应用酵母进行基因表达的研究进展

将目前常用的几种进行基因表达的酵母做了讨论,并对应用酵母进行了基因表达的优缺点和研究状况做了综述。     

人类人工染色体作为转基因载体的应用前景

自1997年首次成功构建人类人工染色体(human artificial chromosome,HAC)以来,对其理论、方法学问题的研究一直就是人们关注的焦点,并引起了科学家们的极大兴趣,目前已能采用不同的方法获得多种类型的HAC。与酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）等相比,HAC不整合到细胞的基因组中,以一个独立的功能性染色体单位而存在,并在细胞中进行正常的有丝分裂和减数分裂。迄今的研究表明：HAC可以携带大片段基因组DNA,是研究人类基因表达和调控、染色体功能基本单元的重要工具,也是建立HAC动物模型的重要手段。在未来的基因治疗方面有着广阔的应用前景。     

外泌体作为疾病诊断标志物及药物载体的应用前景

作为一种纳米级别的囊泡,外泌体的相关研究近年来逐渐成为热点。外泌体来源于细胞内的多囊泡胞内体,经由细胞膜释放到细胞外。由于来自特定细胞类型的外泌体含有多种特异性的蛋白质和microRNA,使其成为了可以广泛用于疾病诊断及预后的新型生物标志物。相较于其他外源性药物载体,外泌体具有更低的免疫原性,并能够靶向作用于病变细胞。这使得由细胞天然产生或经过人工改造的外泌体作为一种新兴的药物载体具有良好的发展前景。特别是近几年,外泌体在临床应用领域的发展潜力不断获得拓展,针对肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、神经退行性病变等重大疾病,以外泌体为基础的疾病诊断和药物的研发都取得了快速的进步。本篇综述重点介绍了外泌体作为一种生物标志物在疾病诊断和预后中的应用,同时阐述了外泌体作为一种新兴的药物载体所具有的优势以及存在的问题。     

药用锌酵母培养吸收应用研究

根据锌的耐受量实验,筛选对锌吸收较好酵母为实验菌株。研究培养条件对酵母细胞锌的含量及生物量的影响,提出药用锌酵母扩大培养工艺流程,探讨药用锌酵母中有机锌的形态,锌的吸收率,锌酵母的毒理分析及应用 。     

巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用

本文介绍了来源于野生型石油酵母Y11430的巴斯德毕赤酵母的3种宿主菌的不同之处,并介绍了其甲醇诱导型基因AOX,同时说明了酵母菌体内微体对合成蛋白质的作用。从启动子类型、启动强弱、终止子及信号肽等方面对整合型载体做了详细的介绍。在外源蛋白表达方面,简要介绍了表达过程,重点讨论了如何防止外源蛋白降解,对影响毕赤酵母高效表达的因素做了扼要论述并提出了相应的解决方案。     

绵羊腺病毒287作为基因传递载体的应用前景

绵羊腺病毒287(OAdV287) 具有独特的基因组结构,全长29 576bp。基因组最大的特点是有很高的A/T含量(66.4%)和缺少典型的E1区,以及含有一段较长的冗余片段。已识别出其基因组中有3个外源基因插入区,理论上最多可容纳6.3kb的外源DNA。OAdV287的纤维和五邻体结构结构独特,衣壳蛋白上缺少可识别的整合蛋白结合域。OAdV287能感染一系列人和动物的细胞系,但是不能在非绵羊源细胞内成功复制。OAdV287载体可以避免人腺病毒的免疫干扰,具有很高的转染效率。目前,OAdV287已成为研究最热的动物源腺病毒载体之一。     

激光在研究生物大分子结构与功能中的应用——酵母甘露聚糖波谱性质和形成分子载体的初步研究

为了进一步了解酵母甘露聚糖的精细结构信息,以便研究其功能,我们采用本实验室“拟规模化制备酵母甘露聚糖新工艺”,从废啤酒酵母（工厂下脚料）和市售鲜酵母细胞壁中制取了纯化的酵母甘露聚糖（ｍａｎｎａｎ）。气相色谱法测定它们的糖组分和其相对含量,并且测定和比较分析酵母甘露聚糖与其组份糖的游离形式（甘露糖和葡萄糖）和酸解后的单体糖的可见—紫外吸收光谱和荧光发射光谱,和以Ｈｅ—Ｎｅ激光为激发光源的红外光谱。从中获得了：组份单糖聚合成甘露聚糖和多聚糖再分解成组份糖单体的光谱特征峰;和这些相关样品的光谱特征峰在聚合和分解过程中的变化与相应糖的细微结构变化的相关光谱信息。这些糖结构光谱特征相关信息为我们制备新型分子载体——甘露聚糖的聚合物（ｐｏｌｙｍａｎｎａｎ）和其功能研究提供了研究基础。     

鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为构建鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体,以本实验室分离鉴定的DuCV GH01株Cap基因为模板,对其进行酵母密码子优化后,连接到pGBKT7载体上构建诱饵质粒,经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,检测诱饵蛋白表达以及诱饵蛋白对酵母细胞毒性和自激活现象。结果表明,优化后的Cap基因全长774bp,成功连接到诱饵载体pGBKT7中,重组质粒pGBKT7-Cap转入酵母细胞后,Western blot检测到50kD左右的蛋白条带,诱饵蛋白对酵母细胞既无毒性,又没有自激活现象。为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Cap蛋白互作的蛋白奠定了基础。     

RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建

白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的关键酶之一,它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res.以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达栽体pBIL-RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件.同时构建了酵母表达载体pVT102U-RS,为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能.     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

运用穿梭载体建立产甘油假丝酵母质粒基因文库

产甘油假丝酵母WL2002─5既具有耐高渗压性能,又能以葡萄糖为原材料高产甘油,且耐高渗压性能与高产甘油的能力相关。本研究以大肠杆菌—酿酒酵母穿梭质粒YEp51为载体,通过对产甘油假丝酵母WL2002─5高分子量染色体DNA的提取、Sau3AI部分酶切、体外重组等建立起产甘油假丝酵母WL2002—5的质粒基因文库,库容为5．3×105,已满足对WL2002—5某一特定基因的克隆。