小肽在原核和真核细胞中抑制α-synuclein异常折叠的研究

目的:研究在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠的小肽,在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中的抑制作用.方法:基于α-Syn疏水区域设计的5种透膜小肽在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠;构建真核表达质粒CMV-SynGFP-IRES-Pn并转入SH-SY5Y细胞,通过测定细胞荧光强度分析小肽抑制α-synuclein异常折叠情况,由此评价大肠杆菌筛选系统确定的小肽在真核SH-SY5Y细胞中的有效性.结果:在大肠杆菌中能有效抑制α-Syn(129A)异常折叠的三种小肽R7P1、R7P3、R7P4,在SH-SY5Y中的作用效果也十分明显,分别比对照肽ASIlD提高了114%、98%和98%.对于α-Syn(53T),R7P1和R7P2在SH-SY5Y中分别比对照提高了90%和44%;然而在两种细胞中,5种透膜小肽对野生型α-Syn(WT)的作用与对照相比差距不明显.     

促进或抑制α-synuclein蛋白异常聚集的相互作用蛋白质

α-synuclein蛋白的异常聚集在共核蛋白病的发病过程中起到了关键性作用。与α-synuclein相互作用的蛋白质对其异常聚集起着不同的调节作用,有的蛋白质(如:蛋白synphilin-1、微管蛋白、A-β肽等)会促进α-synuclein蛋白的异常聚集,而另外一些蛋白质(如:膜联蛋白A5、基于自识别元素设计的小肽等)却能够抑制α-synuclein蛋白的异常聚集。认识与α-synuclein相互作用的蛋白,并研究其作用位点,是从分子水平上理解α-synuclein蛋白质异常聚集、揭示共核蛋白病致病机制,以及设计新药物的基础。分子动力学模拟为开展这方面研究开辟了新的途径。文章对该领域的研究进展进行了综述。     

α-突触核蛋白对小鼠空间学习记忆能力的影响

目的:观察α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对小鼠空间学习记忆能力的影响。方法:以C57/B6野生型小鼠(Wild Type,WT)及α-Syn过表达转基因小鼠(Tg-α-Syn)为研究对象,采用Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)中定位航行实验、空间探索实验以及可视平台实验,按照训练要求,记录两组小鼠游泳路径和完成任务的时间。结果:在定位航行试验中,随着训练时间的增加,两组小鼠的寻台潜伏期均缩短。同时,在训练第五天时,与WT组小鼠相比,Tg-α-Syn小鼠的寻台潜伏期明显延长(58.77±1.32 versus 17.34±6.44,*P0.05)。在空间探索实验中,与WT组小鼠相比,Tg-α-Syn小鼠在目标象限停留时间更短(17.91±2.14versus 5.59±4.98,*P0.05)。为了进一步证明Tg-α-Syn小鼠的空间记忆与学习能力下降是与海马相关,采用了可视平台实验,结果显示:两组小鼠的寻台潜伏期无显著性差异(P0.05),即Tg-α-Syn小鼠不存在运动障碍和视觉障碍。结论:α-Syn过表达可导致海马相关的空间记忆、学习能力受损。     

抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制北大核心CSCD

【目的】研究抗菌肽P7抑制大肠杆菌的非膜作用机制。【方法】P7与溴化乙锭竞争结合大肠杆菌基因组DNA的荧光光谱,分析P7与DNA的结合方式;流式细胞术分析P7与大肠杆菌基因组DNA结合对细菌细胞周期的影响;采用磁珠富集和PCR扩增相结合的方法分析P7特异结合的DNA序列;通过实时荧光定量PCR分析P7对大肠杆菌DNA复制和SOS损伤修复基因表达的影响;核酸染料的荧光分析研究P7对大肠杆菌DNA和RNA合成的影响。【结果】P7以嵌插的方式作用于大肠杆菌基因组DNA碱基对并形成肽-DNA复合物,使溴化乙锭-DNA复合体系的荧光强度减弱。P7可以显著增加大肠杆菌细胞周期中S期细胞数目,抑制大肠杆菌DNA复制。P7特异性结合rnh A使该基因表达水平显著下调2.24倍。同时,在肽的影响下参与大肠杆菌DNA复制相关的ssb、dna G、lig B和rnh A基因的表达水平显著下调(P<0.05),DNA损伤修复的rec A和rec N基因显著上调(P<0.05)。P7可降低大肠杆菌DNA和RNA的合成。【结论】P7特异性地结合rnh A序列引起大肠杆菌DNA的损伤并抑制大肠杆菌的DNA复制。在P7的影响下,参与大肠杆菌DNA复制相关的基因的表达水平下调,DNA损伤修复基因显著上调,同时抑制大肠杆菌DNA和RNA的合成。     

Merlin-1和ezrin对血清反应因子激活功能的调节研究

研究分析同属4.1蛋白家族成员merlin-1和ezrin对RhoGDIα抑制pUS28和Dbs诱导SRF激活的调节作用。利用分子生物学、细胞生物学方法和Dual-Luciferase双荧光检测法分析pUS28和Dbs诱导SRF激活,并分析merlin-1(WT)、merlin-1(S519D)、ezrin(WT)和ezrin(T567D)对RhoGDIα抑制pUS28和Dbs诱导SRF激活的调节影响。pUS28和Dbs均可以组成性的诱导SRF因子激活,而RhoGDIα对pUS28和Dbs诱导SRF激活具有显著抑制效应。野生型merlin-1(WT)和磷酸化模拟重组质粒merlin-1(S519D)均可提高RhoGDIα抑制pUS28诱导SRF激活作用,而野生型ezrin(WT)和磷酸化模拟重组质粒ezrin(T567D)均可以降低RhoGDIα的抑制效果。merlin-1(WT)、merlin-1(S519D)对RhoGDIα抑制Dbs诱导的SRF激活没有显著影响或者调节作用。而ezrin(WT)和ezrin(T567D)降低了RhoGDIα在Dbs诱导SRF激活过程中的抑制能力。因...     

α-突触核蛋白的核易位机制及其功能

α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)是一种脑内含量丰富的可溶性蛋白质,既能参与正常突触功能的维持和囊泡运输,又与多种神经退行性疾病有关,然而其确切的功能目前仍未完全清楚。已有研究表明,在生理条件下,α-突触核蛋白主要定位在细胞质中,少部分能定位在细胞核中,具有多种生物学功能。在帕金森病(Parkinson’s disease, PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)患者大脑及氧化应激的细胞中,均发现α-突触核蛋白趋向于向细胞核中聚集。α-突触核蛋白核易位受到多种因素的精密调控,除自身氨基酸序列外,还受到其129位丝氨酸磷酸化(S129)水平、点突变(A53T, A30P, G51D)、细胞内Ca~(2+)水平的影响,以及核输入蛋α(importin-α)、三结构域蛋白28 (tripartite motif-containing protein 28, TRIM28)等多种蛋白质的精密调控,其异常的核易位则与细胞毒性相关。核易位的α-突触核蛋白能和组蛋白去乙酰化酶及组蛋白甲基化酶相互作用,从而改变组蛋白乙酰化和甲基化水平,最终影响染色质的稳定性。此外,α-突触核蛋白能与DNA相互作用,从而改变DNA构象、参与DNA损伤修复及基因表达调控。本文综述了α-突触核蛋白的结构特征,生理及病理条件下的细胞核内定位现象,详细的核易位机制及其在胞核中的功能研究进展,将有助于了解α-突触核蛋白生理功能及其在疾病发生发展中的作用。     

多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果

为了方便细胞穿膜肽R9融合蛋白的可溶性表达及功能上的研究,构建了pSUMO (小分子泛素样修饰蛋白) -R9-EGFP (增强型绿色荧光蛋白) 原核表达载体。分别纯化EGFP及R9-EGFP蛋白后,作用于HepG2,细胞经流式细胞仪及激光共聚焦检测R9细胞穿膜肽的作用效果。实验结果显示在SUMO分子伴侣的作用下,R9-EGFP融合蛋白获得可溶性表达。经流式细胞仪检测,R9细胞穿膜肽可以快速有效的携带目的蛋白进入细胞内部且呈时间、剂量依赖性,大约1.5 h以后荧光强度进入平台期。共聚焦显微镜检测结果表明R9细胞穿膜肽可以有效携带EGFP进入HepG2细胞,并显示主要聚集在细胞浆内。同时体外经肝素抑制实验显示,肝素抑制R9-EGFP穿膜的效率达到50％。这些结果表明,可以利用pSUMO-R9/Ni-NTA表达纯化系统,快速、有效地表达出可溶性多聚精氨酸融合蛋白,同时R9细胞穿膜肽可以有效地携带目的蛋白进入细胞内,为进一步研究多聚精氨酸的穿膜机制提供了基础。     

基于肠脑轴传播α-突触核蛋白诱发帕金森病的研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是最常见的神经退行性疾病,随着我国人口老龄化加剧,PD病人的增加将造成严重的经济和医疗负担。PD的典型病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元的死亡以及多巴胺能神经元中异常聚集的淀粉样蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)形成病理包涵体即路易小体(Lewy body)。研究发现路易小体不仅存在中枢神经系统中,也同样存在于外周神经系统。肠道内丰富的肠神经系统被称为“第二大脑”。肠脑轴的发现也证明α-Syn能在大脑和肠道进行双向传输。肠道中也存在着庞大的微生物群,这些微生物参与病理性α-Syn的形成和传输。因此文中基于肠脑轴探讨α-Syn在大脑和肠道的双向传输关系,尝试探索肠道微生物群对α-Syn异常聚集的影响。结合目前PD病人的研究和动物模型尤其是非人灵长类实验的研究,希望为PD疾病的筛查和诊断提供参考。     

MODY3相关蛋白HNF1α第249位丝氨酸突变导致小鼠葡萄糖代谢异常

肝细胞核因子1α(HNF1α)不仅是调节葡萄糖代谢的重要转录因子,还参与肝、胰等多个器官中蛋白质合成、物质代谢、增殖分化相关基因的表达调控。HNF1α突变或表达异常引发包括青少年糖尿病3型(maturity onset diabetes of young 3,MODY3)在内的多种代谢疾病。Ser249是HNF1α重要的功能位点,该位点受ATM蛋白激酶直接磷酸化修饰,并可能是ATM蛋白激酶影响葡萄糖代谢的效应靶点,也可能是共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasia,AT)患者糖代谢异常的致病靶点。为进一步研究Ser249磷酸化在体内的功能,本文构建人源野生型HNF1α转基因小鼠(WT小鼠)和HNF1αS249A转基因小鼠(S249A小鼠),对其基础代谢水平和葡萄糖代谢能力进行检测。相较于对照小鼠,S249A小鼠的多项基础代谢指标异常,WT小鼠未显示差异;但当小鼠接受刺激后,无论是注射葡萄糖,还是丙酮酸或胰岛素,相较于各自的对照小鼠,WT小鼠都表现出更强的反应性,而S249A小鼠的糖异生反应和胰岛素敏感性均未显示出差异。实时定量PCR结果表明,WT小鼠肝的多个糖代谢基因表达上调,但S249A小鼠肝中糖代谢基因上调幅度明显小于WT小鼠。本研究提示,HNF1αSer249突变导致小鼠糖代谢异常,可能与磷酸化修饰失调进而影响其转录活性有关。     

狭苞橐吾中几种倍半萜类化合物的活性筛选

本文对山西狭苞橐吾中倍半萜类化合物的生物学活性进行了筛选。用不同浓度的4种艾里莫芬烷型倍半萜干预携带有P53和SV40肿瘤病毒大T抗原基因的AH109菌液,采用酵母双杂交系统的β-半乳糖苷酶活力测定方法,分析了4种倍半萜对P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用力的影响。发现8β-methoxyeremophil-7(11)-ene-12,8α(4β,6α)-diolide(1)和8β-hydroxyl-6β-angloxyeremophil-7(11)-ene-12,8α-olide-15-oic acid(2)对P53蛋白及SV40-大T抗原相互作用没有显著影响,但是中、高浓度的furanoeremophilan-4β,6α-olide(3)和低、中、高浓度的8β-hydroxyeremophil-7(11)-ene-12,8α(4β,6α)-diolide(4)对P53蛋白与SV40大T抗原之间相互作用有抑制效应。说明从山西狭苞橐吾中提取出的化合物3和4对酵母双杂交系统中的P53和SV40-大T抗原的相互作用有生物学抑制活性。     

蛋白质/多肽片段互补分析法检测alpha-突触核蛋白在细胞中的聚集

Alpha-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）聚集是引起帕金森病（Parkinson’s disease, PD）发生发展主要原因。本文用蛋白质/多肽片段互补分析法（protein-fragment complementation assays, PCAs）检测α-syn在细胞内的聚集。分别构建融合α-syn与人工改造的荧光素酶human Gaussiaprinceps luciferase（hGLuc）蛋白N端或C端蛋白的质粒,共转入人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,通过检测酶活性来确定野生型（wild type,WT）及A53T突变体α-syn在细胞中的聚集情况。结果表明WT和A53T突变α-syn都能使荧光素酶活性增强,而且与野生型α-syn相比,突变体A53T的荧光素酶活性更强,说明二者都能聚集,而且A53T聚集程度高于WT。PCAs法具有高灵敏度,不仅能检测α-syn在细胞内的聚集,而且能反映其聚集的程度,为研究帕金森病提供了研究思路和相应药物筛选的有效工具。     

S24795上调星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

该文探讨了S24795激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nicotinic receptors,α7 n ACh Rs)上调内源性αB-晶状体蛋白(αB-crystallin,Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(amyloidβ,Aβ)集聚的现象及其形成机制。分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定;体外制备Aβ1-42寡聚体;将细胞分组处理。用Western blot检测细胞内Cryab、Phospho-Akt、Aβ寡聚体的水平。结果显示,S24795可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白质,该上调效应能被(methyllycaconitine,MLA)或LY294002抑制;S24795能够显著上调磷酸化Akt水平上调,该上调效应能被MLA或LY294002抑制;在细胞裂解液及培养基中,S24795显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用,该效应被LY294002抑制。该研究结果提示,磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)信号通路可能参与S24795激活星形胶质细胞α7 n ACh Rs上调内源性Cryab的表达,从而进一步抑制Aβ集聚。这为进一步研究S24795抑制Aβ集聚的可能机制提供了实验基础。     

4例乙肝表面抗原阴性乙肝病毒DNA阳性标本结果分析

目的 探讨4例乙肝病毒HBV-DNA阳性标本乙肝表面抗原(HbsAg)阴性的原因.方法 4例HbsAg阴性HBV-DNA阳性标本和1例HbsAg阳性HBV-DNA阳性标本,碱裂解法提取乙肝病毒基因组,采用巢式PCR扩增s基因全长片段,T-A克隆后测序,根据s基因序列推导氨基酸序列,分析乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸变异情况.结果 与参考株比较,5例血清中HBV-DNAs基因均出现不同位点碱基突变,导致乙肝表面抗原α决定簇区域的氨基酸突变主要为:1号标本R122K、I126A、S143T;2号标本R122K、I126N、Q129N;3号标本R122K、I126S、T131N、M133T;4号标本R122K、I126S、T131N、M133T及5号标本的R122K.结论 乙肝表面抗原α决定簇区域126位氨基酸突变可能会影响HbsAg的检测结果.     

9R穿膜肽可增强P53抗肿瘤效果

为解决P53蛋白难以进入细胞内部发挥治疗作用的瓶颈难题.将p53基因融合插入带有9个精氨酸作为穿膜肽的表达载体中表达融合蛋白CPPs-P53,并与没有穿膜肽的P53蛋白进行比较,利用Western blotting方法检测蛋白的表达情况,MTT及Annexin V/PI双染法检测细胞生长抑制率及细胞凋亡率.Western blotting检测表明已成功在原核表达系统中表达融合蛋白CPPs-P53和P53蛋白,且蛋白纯度均已达到90％以上;MTT检测表明,P53蛋白对肿瘤细胞的生长虽有一定的抑制作用,但融合蛋白CPPs-P53与之相比,对肿瘤细胞生长的抑制效果显著增强,细胞生长抑制率有明显的提升,并且细胞生长抑制率呈现剂量依赖性;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况也表明P53虽可以在一定程度上诱导肿瘤细胞的凋亡,但与P53蛋白相比较,融合蛋白CPPs-P53诱导的凋亡细胞明显增加,凋亡率是P53蛋白的2～3倍.由此说明在抑制肿瘤细胞的生长和诱导细胞凋亡方面,CPPs-P53比没有穿膜肽的P53蛋白的效果更显著.     

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。     

利用定点突变法研究精氨酸脱亚胺酶活性的影响机制

精氨酸脱亚胺酶(ADI)是一种针对精氨酸缺陷型癌症(如:肝癌、黑素瘤)的新药,目前处于临床三期试验。文中通过定点突变技术分析了精氨酸脱亚胺酶的特定氨基酸位点对酶活力的影响机制。针对已报道的关键氨基酸残基A128、H404、I410,采用QuikChange法进行定点突变,获得ADI突变株M1(A128T)、M2(H404R)、M3(I410L)和M4(A128T/H404R)。将突变株在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达,并对纯化获得的突变蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变位点A128T和H404R对ADI最适pH的提高,生理中性(pH 7.4)条件下的酶活力和稳定性的提高,以及Km值的降低均具有显著的作用。研究结果为阐明ADI的酶活力影响机制和蛋白质的理性改造提供了一定的依据。     

一例Hb Ottawa[αl5(A13)Gly→Arg]的化学结构分析

本文报道在一个8岁汉族女孩血液中发现一种慢速异常血红蛋白。家系调查结果显示,异常基因来自其母。取患者静脉血制备珠蛋白,然后分离异常肽链,进行异常肽链的胰蛋白酶酶解物指纹图谱分析和异常肽段的氨基酸定量分析。结果证明血红蛋白α链第15位甘氨酸被精氨酸所取代,该变异体是Hb Ottawa(α15(A13)G1y→Arg)。本例异常血红蛋白在国内系首次发现。     

来自穿膜肽的新肽的抗菌活性及抑菌机制

[目的]研究基于穿膜肽和抗菌肽构效关系改造获得的新肽P7的抗菌活性及其对大肠杆菌(E.coli)的抑菌机制.[方法]微量稀释法和溶血实验分析P7的抑菌活性及其对正常细胞的细胞毒性;采用膜荧光探针、流式细胞术和扫描电镜分析P7对E.coli膜通透性、膜完整性的影响和细胞超微结构变化;通过激光共聚焦分析P7在E.coli细胞中的定位;凝胶阻滞实验测定P7与E.coli基因组DNA结合能力.[结果]P7比母肽显示更强的抑菌活性,最低抑菌浓度范围为4-32 μmol/L,且在作用浓度范围内具有较弱的溶血活性.P7可以增加E.coli外膜和内膜的通透性,使E.coli细胞膜的完整性和细胞表面结构受损.同时P7可以穿过E.coli细胞膜在细胞质聚集并与基因组DNA结合.[结论]P7通过增加E.coli内外膜通透性,穿过细胞膜与胞内DNA结合发挥抑菌活性.     

胸腺肽α1-Spl DnaX内含肽融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肽α1(Tα1)与Spl DnaX内含肽融合蛋白AS的体外切割动力学。方法:构建Tα1和SplDnaX内含肽的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肽介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响。结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肽介导的切割率逐渐增大;最终采用300 mmol/Lβ-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%。结论:通过对Spl DnaX内含肽的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tα1和其他小分子多肽提供了技术基础。     

藏药臭蚤草中11个倍半萜化学成分研究

首次进行中国特有菊科藏药臭蚤草(Pulicaria insignis Drumm.ex Dunn)的化学成分研究,从全草中分离得到11个倍半萜类化合物,通过波谱数据分析分别鉴定为Xanthanolide(1),(3αR,4αR,5R,7αS,9αS)-5-Hy-droxy-5-methyl-3,8-dimethylenedecahydroazuleno[6,5-β]furan-2(3H)-one(2)10α-Hydroxy-14H-inuviscolide(3),(3R,3αR,4αS,7αS,8S,9αS)-3,4α,8-Trimethyldecahydroazuleno[6,5-β]furan-2,5-dione(4)8-Epi-conferti(5),(3αR,5S,11αS,E)-5-Hydroxy-10-methyl-3,6-dimethylene-3α,4,5,6,7,8,11,11α-octahydrocyclodeca[α]furan-2(3H)-one(6),(3αR,8αR,9αR)-5,8α-Dimethyl-3-methylene-3α,4,8,8α,9,9α-hexahydronaphtho[2,3-β]furan-2,6(3H,7H)-dione(7),Pterodonoic acid(8),8-Epi-isovangustin(9),(3αR,4αS,8R,8αR,9αR)-8-Hydroxy-5,8α-dime-thyl-3-methylene-3,3α,4,4α,8,8α,9,9α-octahydronaphtho[2,3-β]furan-2(7H)-one(10),(5S,8αR,9αR)-3-(Hydroxymethyl)-5,8α-dimethyl-6,7,8,8α,9,9α-hexahydronaphtho[2,3-β]furan-2(5H)-one(11)。所有化合物均首次从该植物中分离得到,同时补充了文献中化合物6和9所缺少的碳谱数据。