菠菜光系统I反应中心的电子自旋共振研究

利用温和的SDS-PAGE法分离纯化了菠菜光系统Ⅰ的反应中心复合物(CP1),并进行了低温(77K)和室温下的电子自旋共振谱(ESR)测定,获得了自由基P700~+的ESR吸收信号.其一级微分谱的g值为2.0024,谱线近以于高斯型,与从菠菜叶绿体中发现的P700~+的ESR信号相符.根据这些结果,我们认为以温和SDS-PAGE法从菠菜得到的CP1组份保存了大部分P700的光氧化活性.     

辣椒温和斑点病毒(PMMV)外壳蛋白基因的克隆和序列测定

从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA.根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用RT-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD 18-T载体,转化感受态受体菌XL1-B1ue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子.序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%.     

核酸及其与组蛋白相互作用的~1H、~(13)C、~(31)P核磁共振研究

本文报道了酵母、大白鼠正常肝、大白鼠肝癌、大白鼠再生肝、大白鼠胚胎肝等的RNA的低场区质子主峰化学位移是各不相同的。酵母RNA的~(13)C谱能观察到24组碳原子峰,其~(31)P核磁共振信号出现在1.20ppm处;半高宽为40Hz。小牛胸腺、大白鼠肝和大白鼠脾等的组蛋白~1H谱的化学位移和波谱特征是相同的。小牛胸腺组蛋白的~(13)C谱可观察到5组碳原子峰。大白鼠脾组蛋白与酵母RNA相互作用后,组蛋白的质子峰变弱。酵母RNA与小牛胸腺组蛋白相互作用后,RNA低场Ⅱ区和Ⅰ区的质子峰变弱;~(31)P核磁共振信号完全消失。聚核苷酸I:C与组蛋白相互作用后,~(31)P核磁共振信号完全消失;聚核苷酸C与组蛋白相互作用后,~(31)P核磁共振信号强度约降低一半左右。     

TRPS1在胃癌中的表达及生物信息学分析

目的探究转录抑制因子GATA结合基因1(TRPS1)在胃癌中的表达水平及其与表达相关基因的细胞功能及信号通路。方法通过筛选基因表达谱数据动态分析(GEPIA)、基因芯片表达谱公共数据库(GEO)数据,对TRPS1在胃癌组织中的数据进行Meta分析。采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测TRPS1在胃癌细胞中的表达水平。应用生物信息学分析TRPS1及表达相似基因的细胞功能和信号通路。结果在公共数据库中,TRPS1在胃癌组织中均呈高表达,合并标准均差SMD为0.40(95%CI:0.04～0.76,P=0.028),敏感性分析稳定,无发表偏倚。TRPS1在胃癌细胞HGC-27和MGC-803中呈高表达(均P0.01)。TRPS1和表达相关基因ESR1富集在多条功能通路中,与转录因子活性、序列特异性DNA结合等肿瘤相关通路密切相关;TRPS1与ESR1存在直接蛋白互作关联。结论 TRPS1在胃癌中可能是一个促癌因子,在胃癌的调控机制中有重要作用。     

人白血病细胞癌性促凝物(CP)的分离纯化及其特性的初步研究

用三步纯化法从人M_3型白血病细胞中分离纯化出人类肿瘤癌性促凝物(CP)。促凝活性回收率为24％,CP纯化倍数为2481倍。纯化CP在SDS-PAGE上为单一区带,其理化和酶学特性类似于动物肿瘤CP,分子量约为70 000,PI为4.8,在FVⅡ缺乏血浆中以及在含有组织因子(TF)抑制剂情况下仍能激活FX。CP促凝活性能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂HgCl_2抑制,纯化CP能与抗动物肿瘤CP抗体形成免疫沉淀反应。     

高等植物光系统Ⅱ中强光照射产生地超氧阴离子自由基的ESR探索

利用自旋捕捉电子顺磁共振(ESR)的方法对从菠菜叶绿体中分离提纯的光系统Ⅱ(PSⅡ)颗粒产生Q2的机理进行了直接检测.通过对样品充氧、加入超氧化物歧化酶(SOD)抑制剂四氰乙烯(TCNE)以及原位光照检测ESR信号等手段,在PSⅡ中检测到O2与DMPO加合物的特征ESR信号.而在没有SOD抑制剂的情况下,光照时PSⅡ中O2与DMPO加合物浓度显著下降.进一步实验发现PSⅡ中O2产率与氧分子浓度直接正相关.O2产率还具有pH值依赖性,在pH值为6.0～6.5范围内,O2产率最高,大于此范围时则呈显著下降趋势.而PSⅡ颗粒的Tris处理也将导致O2产率的急剧减少.以上结果证实水裂解放氧十分活跃的PSⅡ也是高等植物叶绿体在光照下产生活性O2的主要部位,通常大部分的O2能被内源SOD清除,且O2的生成与PSⅡ的电子传递活性密切相关.     

高等植物光系统Ⅱ中强光照射产生

利用自旋捕捉电子顺磁共振(ESR)的方法对从菠菜叶绿体中分离提纯的光系统Ⅱ(PSⅡ)颗粒产生Q2的机理进行了直接检测.通过对样品充氧、加入超氧化物歧化酶(SOD)抑制剂四氰乙烯(TCNE)以及原位光照检测ESR信号等手段,在PSⅡ中检测到O2与DMPO加合物的特征ESR信号.而在没有SOD抑制剂的情况下,光照时PSⅡ中O2与DMPO加合物浓度显著下降.进一步实验发现PSⅡ中O2产率与氧分子浓度直接正相关.O2产率还具有pH值依赖性,在pH值为6.0～6.5范围内,O2产率最高,大于此范围时则呈显著下降趋势.而PSⅡ颗粒的Tris处理也将导致O2产率的急剧减少.以上结果证实水裂解放氧十分活跃的PSⅡ也是高等植物叶绿体在光照下产生活性O2的主要部位,通常大部分的O2能被内源SOD清除,且O2的生成与PSⅡ的电子传递活性密切相关.     

琼脂糖平板制备聚焦电泳法进一步提纯胸腺素组分五

用琼脂糖平板等电聚焦电泳法,由胸腺素组分五中分离出三种在聚焦电泳谱上是单一谱线的多肽成份——CP1、CP2和CP3,等电点分别为4.3、4.9和5.6。测定了这些多肽对脐带血中淋巴细胞形成羊红细胞玫瑰花的影响。与对照相比,CP1(2微克/0.6毫升),和CP3(0.2-2微克/毫升)分别在统计学上呈显著和非常显著差异。在相同测定条件下,这三种多肽成份的活性均高于化学合成的胸腺多肽——胸腺素α_1。     

大蒜A病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

根据GenBank报道的大蒜A病毒(GarV-A)序列设计引物、扩增其外壳蛋白基因并进行序列分析.结果表明,GarV-A的CP基因与目前已报道的两种GarV-A不同分离物CP基因的核苷酸序列同源性为98％-99％;氨基酸序列同源性均为98％.将GarV-A CP基因插入表达载体pSBET,在大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株中诱导表达.CP经12％SDS-PAGE和5％-20％SDS-PAGE两次纯化,免疫小鼠获得抗CP血清,Western blotting分析表明确定制备的抗体对CP具有高度特异性,ELISA检测表明制备的抗体能够与天然病毒离子结合,因此可以作为该病毒的检测.     

高粱花叶病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清制备

高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)是世界上分布最广的侵染甘蔗的病毒之一,引起甘蔗花叶病,对甘蔗产业危害很大。根据SrMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列合成一对引物,以海南(SrMV-HN)染病植株总RNA为材料,采用RT-PCR方法克隆了长约987 bp的目的片段。将CP基因与质粒pET32a(+)连接,构建了含SrMV CP基因的融合蛋白原核表达载体pET32a-SrMVCP。然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测出一条约36kD的特异融合蛋白表达谱带。融合蛋白主要以可溶性蛋白形式稳定表达。通过优化诱导条件,确立了CP基因表达的最佳条件:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为4 h,诱导温度为30℃。用Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白,免疫家兔制备出抗血清。通过酶联法(ID-ELISA)测定本试验制备的SrMV CP抗血清工作浓度为1∶1 000,Western blotting检测结果表明,抗血清与SrMV-HN诱导表达的CP蛋白发生特异性反应。对田间25个甘蔗样品进行检测,结果表明该抗血清的效价高、灵敏度高、特异性强,可以应用于田间样品的检测。     

侵染浙贝母3种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测

根据GenBank报道的浙贝母花叶病毒(Thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)、浙贝母Y病毒(Fritillary virus Y,FVY)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)序列设计引物,扩增其CP基因。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,IPTG诱导表达。经12% SDS-PAGE和5%~20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,分别免疫小鼠获得抗CP血清。采用Western blot分析确定抗体的特异性及其之间的血亲学关系;采用ELISA分析确定抗体是否能与天然病毒粒子结合。采用Western blot、间接ELISA法和Dot-ELISA 法检测侵染浙贝母的3种病毒。结果表明,制备的抗体对CP有高度特异性,相互之间无交叉反应,且能与天然病毒离子结合。制备的抗血清可以用于检测3种病毒,其中间接ELISA法和Dot-ELISA法检测效果较好。     

生物分离法制备细胞色素C质量的影响因素

细胞色素C为临床上应用广泛的生化药品。为了提高细胞色素C的质量,对制备过程中影响细胞色素C质量的因素进行考察,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对不同工艺制备的细胞色素C进行纯度分析,并对SDS-PAGE图谱中约2.5×10~4的蛋白质进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析与鉴定。结果表明:在SDS-PAGE电泳图中,使用三氯乙酸(TCA)沉淀剂的传统工艺制备的细胞色素C样品除了有1.22×10~4的细胞色素C,还包括1个约2.5×10~4的蛋白分子;而不使用三氯乙酸沉淀剂的新工艺制备的细胞色素C样品,仅有1.22×10~4的细胞色素C,而未发现约2.5×10~4的蛋白。SDS-PAGE图谱中分子量2.5×10~4的蛋白分子的LC-MS/MS分析与鉴定结果表明其与猪源细胞色素C覆盖率最大(达到76%),结合其分子量大小,可以证明该蛋白为细胞色素C二聚体。细胞色素C制备过程中三氯乙酸沉淀剂易导致细胞色素C形成二聚体,故三氯乙酸是影响细胞色素C质量的关键因素之一。     

Mn~(2+)和Cu~(2+)与脂质体和脂酶体相互作用的ESR研究

用ESR实验研究了Mn~(2 )、Cu~(2 )与DOPC,DPPC,SPL,DOPA,DPPA脂质体及其与H~ -ATP酶复合体重组的脂酶体的相互作用.通过Mn~(2 )—ESR谱线强度以及Cu~(2 )—ESR谱g因子的测量得出,磷脂分子头部不同的化学组成及其脂酰链的不同状态决定了Mn~(2 )、Cu~(2 )与膜脂结合的强弱程度,通过脂质体和脂酶体中自旋标记物5NS—ESR谱的测量进一步得出Mn~(2 )的结合增大了膜脂排列的序参数,而酶复合体的嵌入都导致与膜脂结合的Mn~(2 )比例减小.因而,当Mn~(2 )与脂酶体相互作用时,膜脂的排列最终达到一个平衡状态.在中性磷脂脂酶体的膜与Mn~(2 )之间,这种相互作用不明显.     

大豆花叶病毒CP基因原核表达与抗血清制备

根据已报道的大豆花叶病毒(SMV)序列设计引物,扩增SMV的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的SMV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为85.0%～96.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为87.9%～98.9%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose 亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1∶ 3 800的一抗,可用于田间SMV病样检测.     

植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进

通过缩短DEAE-Cellulose柱长度,加快流速并采用pH8.8的80mmol.L-1Tris-HCl为洗脱液,可在9小时内快速地从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化得到乙醇酸氧化酶。该酶具高活性(54.6～197.0U.mg-1)及高等电点(pI>10.0)。产率为4.1%～71.5%,纯化倍数为21.6～122.68。经SDS-PAGE检测均有40kD带,表明3种植物乙醇酸氧化酶的亚基大小无区别。     

植物乙醇酸氧化酶分离纯化方法的改进

通过缩短DEAE-Cellulose柱长度, 加快流速并采用pH8.8的80 mmol.L-1 Tris-HCl为洗脱液, 可在9小时内快速地从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化得到乙醇酸氧化酶。该酶具高活性(54.6～197.0 U.mg-1)及高等电点(pI >10.0)。产率为4.1%～71.5%, 纯化倍数为21.6～122.68。经SDS-PAGE检测均有40 kD带,表明3种植物乙醇酸氧化酶的亚基大小无区别。     

紫藤脉花叶病毒cp基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

采用RT-PCR方法自紫藤脉花叶病毒北京分离物(WVMV-BJ)的基因组中分离出其CP基因,连接到原核表达载体pET22b(+)上.获得的重组子pET-WVMVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析表明,cp基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量约为34.4 kDa.将融合蛋白纯化后免疫兔子,获得了特异性较高的抗血清.微量免疫沉淀法测定该抗血清的效价为1/1024,酶联法(enzyme-linkedimmunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1/8192.     

洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制

根据已报道的洋葱黄矮病毒(OYDV)序列设计引物,扩增洋葱黄矮病毒(OYDV)六安分离物外壳蛋白(CP)基因.序列同源性分析结果表明,与目前已报道的OYDV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84.0%～95.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为86.8%～97.6%.将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达.通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性.硫酸铵沉淀初步IgG,然后用Protein A-Red Sepharose亲和层析进一步纯化IgG,IgG与甘油1: 1混合获得效价1: 4 800的一抗.将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成OYDV检测试剂盒,可用于田间OYDV病样检测.     

α-生育酚模型—色满酚氧自由基的电子自旋共振研究

本文研究了一种新α-生育酚(维生素E)模型化合物——手性2,5,7,8—四甲基—2—乙氧基—6—羟基色满(ETC)的抗氧化性能.以甲苯为溶剂,以二叔丁基过氧化物为氧化剂,在紫外光的照射下记录色满酚氧自由基的ESR谱.并测得超精细偶合常数,用计算机描绘出色满酚氧自由基的模拟谱.在无氧条件下,ETC酚氧自由基信号缓慢地出现,随着时间的推移信号逐渐增强.在20分钟后呈极大值,然后信号逐渐减弱.在含氧条件下,ETC酚氧自由基信号速增速减,40分钟后趋于稳定.样品停止光照半小时之后,上述现象均可重复.据此,本文对ETC酚氧自由基的形成及反应性进行了讨论.     

测定P700和P680差示光谱的实验条件和材料的选定

由叶绿体的光合膜与线粒体的嵴膜组成的复合体称之为融合膜。为了研究融合膜中的光合电子链与呼吸链的衔接位点,需要制备PSⅠ,PSⅡ颗粒复合体。但发现菠菜材料的不同对PSⅠ,PSⅡ颗粒的纯度和含量都有很大影响。为此,我们对菠菜材料的取样,以及代表PSⅠ和PSⅡ颗粒的特征光吸收信号P_(700)与P_(680)的氧化还原光谱测定条件进