阴沟肠杆菌基因nifA经转座子Tn5整入催娩克氏杆菌NG13的基因组

根际固氮细菌与禾谷类作物如水稻、小麦、玉米等进行联合固氮,能使作物有不同程度的增产（APp等1980,Watanable和hn1984）。水稻是世界上主要粮食作物之一,因此,研究增强水稻根际细菌的联合固氮作用,吸引着科学家们的兴趣。催娩克氏杆菌（KMFithemp）NG13与水稻能进行有效的联合固氮（Yoo等1986）。但是在有氨的生长条件下,细菌的固氮活力受到阻遏。ZhU等将带有nifA的重组质粒引进阴沟肠杆菌EZ6后,观察到有氨存在条件下固氮酶组成型生成。我们实验室构建了具有广泛接合转移特性的阴沟肠杆菌Tns－nifA嵌合质粒PBF101,基因nif…     

含hup基因的质粒在催娩克氏杆菌中的稳定性及吸氢酶的表达

以质料pKT230为载体,亚克隆大豆根瘤菌吸氢酶结构基因（hupSL）片段,构建成嵌合质粒pKH1。将质粒分配系统基因（parDE）片段和吸氢酶结构粒pRKBH。质粒pKH1、pRKBH和载体pRK415经转化和三亲本杂交,得到DH5α/pHR11、DH5α/pRKBH、pRK415、NG1390/pHR11、NG1390/pRKBH和NG1390/pKH1(NGH982)等接合子。稳定性分析发现,质粒pKH1在催娩克氏杆菌中传80代后仍有92％以上的菌株含此质粒,说明质粒pKH1有较高的稳定性。吸氢酶活性分析表明,H2诱导接合子NGH999和NGH982吸氢酶活性高表达,同时固氮效率和固氮酶活性也高。低碳源浓度更有利于接合子吸氢酶活性的表达和固氮效率的提高。接合子NGH982具有耐铵的基因,因此其固氮酶活性的表达有部分去铵阻遏的作用。     

阴沟肠杆菌Tn5—nifA重组质粒的构建及其nifA的表达分析

构建的生组质粒ＰＢＦ１０１带有阴沟肠植菌Ｅ２６固氮基因ｎｉｆＡ片段,该质粒具有广泛宿主范围接合转移特性和转座子Ｔｎ５的转座作用。验证了Ｅ２６ｎｉｆＡ产物能激活肺炎克氏杆菌ｎｉｆＨ启动子的表达。解除氨对固氮酶合成的阻遏作用。发现当ＰＨＦ１０１引入自生固氮催娩克氏杆菌ＮＧ１３后,可观罕到固氮酶的组成型生成,同时在３９℃高温条件下的细菌仍能检测到部分固氮活性。     

水稻根际兼性厌氧催娩克氏杆菌和阴沟肠杆菌的固氮与氢代谢

兼性厌氧细菌Enterobacter cloacae菌株E-26和Klebsiella oxytoca菌株NG-13的氢酶与固氮酶同时形成。固氮的最佳碳源为蔗糖、葡萄糖和丙酮酸,此外延胡索酸和苹果酸也能支持固氮。支持固氮的碳源也支持放氢,两者动力学基本一致。40％乙炔预处理后,吸氢活性下跌,放氢量未增加;NH_4~ 抑制固氮酶,但未导致放氢量降低;可能E-26菌株的放氢主要依赖于氢酶。菌株E-26和NG-13的吸氢反应,既能以O_2为电子受体,也能以延胡索酸、硝酸、MB为电子受体。但仅延胡索酸为电子受体时,E-26菌的固氮活性被分子H_2促进,它的氢吸收利用与固氮相偶联;而在CO_2和NH_4~ 代谢与H_2利用之间并无明显相关性,吸氢活性不被CO_2和NH_4~ 促进。     

耐氨固氮的催娩克氏菌的高密度培养研究

根据耐氨固氮型催娩克氏菌的特点,对其发酵工艺进行了研究。确定了以葡萄糖为碳源,合理搭配适量的氮源及无机盐作为高密度培养的基础培养基;在培养的中后期,添加葡萄糖补充碳源,流加氨水补充氮源,同时将pH值稳定在6.5～6.8之间,通过控制适当的通气量、搅拌速度以维持适当的溶氧水平。培养终止时,NG13/pMC73A的菌数达到600～700×108cfu/mL,与原有工艺相比,菌数提高十倍以上,而培养周期基本相同。     

含hup基因的质粒在催娩克氏杆菌中的稳定性及吸氢酶的表达

以质粒pKT230为栽体,亚克隆大豆根瘤菌吸氢酶结构基因(hupSL)片段,构建成嵌合质粒pKH1。将质粒分配系统基因(parDE)片段和吸氢酶结构基因(hup)片段插入载体质粒pRK415,构建成质粒pRKBH。质粒pKH1、pRKBH和载体pRK415经转化和三亲本杂交,得到DH5α/pHR11、DH5α/pRKBH、E1201/pKH1、NG13/pKH1(NGH999)、NG1390/pRK415、NG1390/pHR11、NG1390/pRKBH和NG1390/pKH1(NGH982)等接合子。稳定性分析发现,质粒pKH1在催娩克氏杆茵中传80代后仍有92％以上的菌株含此质粒,说明质粒pKH1有较高的稳定性。吸氢酶活性分析表明,H