京大戟hmgr基因家族3个保守区片段的克隆与分析

采用RT-PCR技术以及两条简并引物,以京大戟嫩叶总RNA反转录的cDNA为模板扩增3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的保守区片断。序列分析表明,所克隆的cDNA保守区序列长度为458 bp,而且同时得到了三个不同的核苷酸序列,分别命名为hmgr1、hmgr2、hmgr3。与之前得到的京大戟hmgr保守区片段的核苷酸序列的同源性分别为98.03%、96.29%、78.38%,推断的相应氨基酸序列的同源性分别为98.68％、96.71%和85.53%。推断这可能是该基因家族中的三个新的成员。而且同源序列比对发现,由这三个核苷酸序列推断的氨基酸序列与其它植物都有较高的同源性。种系进化树分析表明hmgr3与hmgr1、hmgr2及以前报道的京大戟的hmgr之间有较大的差别。     

大戟甲羟戊酸途径关键酶基因hmgr的克隆与分析

通过比较6种植物8条甲羟戊酸途径关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因同源区域,设计简并引物,利用RT-PCR技术成功地从大戟(Euphorbia pekinensis)叶中扩增出458bp的基因片段。通过BlastP比较,所推断的大戟HMGR蛋白序列与杜仲Eucommia ulmoides(AAV54051)、穿心莲Andrographis paniculata(AAP14352)、胡黄连Picrorhiza kurrooa(ABC74565)、橡胶树Hevea brasiliensis(AAU08214)、海岛棉Gossypium barbadense(ABC71314)、龙胆草Gentiana lutea(BAE92730)的一致性分别达到90%、86%、86%、92%、87%和88%。蛋白质保守区、特征区以及进化树分析,初步证实该基因为hmgr基因,这是首次报道从药用植物大戟中克隆到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段。     

大戟甲羟戊酸途径关键酶基因hmgr的克隆与分析

通过比较6种植物8条甲羟戊酸途径关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因同源区域,设计简并引物,利用RT-PCR技术成功地从大戟(Euphorbia pekinensis)叶中扩增出458bp的基因片段。通过BlastP比较,所推断的大戟HMGR蛋白序列与杜仲Eucommia ulmoides(AAV54051)、穿心莲Andrographis paniculata(AAP14352)、胡黄连Picrorhiza kurrooa(ABC74565)、橡胶树Hevea brasiliensis(AAU08214)、海岛棉Gossypium barba-dense(ABC71314)、龙胆草Gentiana lutea(BAE92730)的一致性分别达到90%、86%、86%、92%、87%和88%。蛋白质保守区、特征区以及进化树分析,初步证实该基因为hmgr基因,这是首次报道从药用植物大戟中克隆到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段。     

南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2 160 bp,包含一个1 758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示TmiHMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。     

杜仲橡胶合成相关酶基因HMGR的克隆与表达分析

为解析HMGR基因在杜仲橡胶生物合成中的作用,本研究以杜仲良种华仲6号叶片和果皮为材料,参考杜仲基因组和转录组数据,克隆了杜仲HMGR基因,命名为Eu HMGR,全长1770 bp,编码590个氨基酸。实时荧光定量PCR测定结果显示,EuHMGR基因在果皮中的表达量于5月中旬达到最大值,而在叶片中的最大值出现在7月中旬。通过索氏提取测定相应时期果皮和叶片的含胶量表明,果皮中的含胶量从4月中旬到5月下旬迅速增加,而叶片中的含胶量一直平稳增长。分析不同发育时期果皮和叶片Eu HMGR基因表达量和含胶增长速率相关性发现,果皮Eu HMGR基因在不同发育时期的相对表达量和含胶增长速率呈显著正相关,而二者在叶片中无明显相关性。因此,推测Eu HMGR基因的表达与杜仲果皮中橡胶生物合成相关。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

麦红吸浆虫3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR的克隆及在滞育与发育变态过程中的表达动态

【目的】3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是保幼激素(JH)合成途径的限速酶。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana是一种典型的专性幼虫滞育昆虫。本研究旨在探讨HMGR基因在麦红吸浆虫滞育和发育变态过程中的作用。【方法】通过RT-PCR和RACE技术克隆麦红吸浆虫滞育前幼虫HMGR基因全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析HMGR基因核苷酸和其编码的蛋白氨基酸序列特性;采用qPCR技术测定其在麦红吸浆虫滞育不同时期3龄幼虫及不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹和后蛹以及雌雄成虫)中的mRNA表达水平。【结果】克隆获得一条麦红吸浆虫HMGR基因全长cDNA序列,命名为SmHMGR(GenBank登录号: MG876766)。该基因全长2 548 bp,其中开放阅读框长2 328 bp,编码775个氨基酸,预测的蛋白分子量为84.16 kD,理论等电点为8.29。序列分析发现该基因编码的蛋白具有HMGR蛋白家族典型的HMG-CoA-reductase-classⅠ催化功能域及其他保守功能基序;序列比对和系统发育分析表明,SmHMGR与达氏按蚊Anopheles darling等长角亚目(Nematocera)昆虫HMGR的相似性最高、亲缘关系最近。SmHMGR在麦红吸浆虫滞育前的3龄早期幼虫中表达量显著升高,进入滞育后一直维持较高水平,并在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月达到最高。SmHMGR在蛹期表达量低于幼虫期,预蛹期表达量最低;在雌成虫中表达量显著高于在蛹和雄成虫中的表达量。【结论】SmHMGR的表达与麦红吸浆虫发育密切相关,可能在滞育诱导、维持及滞育后静息状态的维持及生殖中发挥作用,其表达量的降低可能参与了幼虫到蛹的变态。     

植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的橡胶、烟草、辣椒、穿心莲等植物的萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、信号肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无信号肽,是一个跨膜的亲水性蛋白,包括两个功能HMG-CoA结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则盘绕是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间布局上折叠成“V”形,“V”形的两臂由螺旋状的N结构域和S结构域构成,中间部分由L结构域构成。     

植物3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因研究进展

细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、叶绿素、萜类等类异戊二烯物质,是植物中广泛存在的一类代谢产物,在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。一些萜类化合物作为药物的合成前体或有效的药用成分在工农业及医药生产上具有重要的经济价值。类异戊二烯物质主要通过甲羟戊酸代谢途径中的一系列酶催化合成,其中,3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)是该代谢途径中的第一个关键限速酶,能够将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化成中间代谢产物甲羟戊酸。对植物HMGR基因的克隆、酶结构和功能分析、基因组织表达及调控等方面进行了综述,旨在为其在重要农作物的遗传改良、代谢产物工程植物创制以及植物亲缘关系分析中的应用等研究提供理论依据。     

菊花等中药水煎剂对离体大鼠肝细胞微粒体羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的作用机理

The isolated rat hepatic microsomal preparation was incubated with the aqueous extracts of Flos chryranthemi(菊花), Curcuma aromatica Salisb(郁金), Acan- thopanax senticosus (刺五加), Rhizoma ligustici wallichii (川芎), Radix polygoni multiflori (首乌) and Fructus crataegi pinnatifidae (山楂), respectively (37% 20 min). The activity of hydroxymethlglutaryl coenzyme A reductase was found to decrese about 30 % corresponding to the action of 50mmol/L NaF at similar condition. The mechanism of action of the Chinese drugs was the inhibition of cytosolic protein phosphatase and the activation of cytosolic hydroxymethylglutaryl CoA reductase kinase. Both the results of these two actions suppressed the activity of HMG-CoA reductase.     

橡胶草HMGR基因的克隆及表达分析

通过比较9种植物的9条甲羟戊酸途径关键酶3-羟基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）氨基酸同源区域,设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术首次从橡胶草（Taraxacum kok-saghyz）中克隆了一个HMGR基因,命名为TKHMGR。通过氨基酸序列同源性比对与系统进化分析表明,TKHMGR属于HMGR基因家族的新成员。同时,利用荧光定量方法分析了该基因在不同组织的表达情况。     

细纹豆芫菁3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi (Maklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列, 命名为EmHMGR（GenBank登录号为JQ690539）。该基因全长3 118 bp, 其中5′端非翻译区178 bp, 3′端非翻译区414 bp, 开放阅读框2 526 bp, 编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8 kDa, 理论等电点为6.0, 预测分子式为C₄₁₃₅H₆₆₀₄N1₀₉₈O₁₂₁₆S₅₀, 不稳定系数为43.37, 总亲水性系数为0.091, 为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上, 而且包含HMGR_Class I保守功能域、 固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因, 为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。