突变型hTNFα重组体的构建及其在真核细胞中的表达

选择一种高效低毒的ｈＴＮＦαｃＤＮＡ突变体为目的基因,以质粒ｐｃＤＮＡ３１（＋）为载体,构建了ｈＴＮＦα重组体ｐｃＤＮＡ３１（＋）－ｈＴＮＦα。经限制性内切酶分析证实了重组体结构的正确性,用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法将重组体导入鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３中,测其瞬时表达,证明重组体有表达突变型ｈＴＮＦα蛋白的功能。突变型ｈＴＮＦα表达质粒的成功构建,为其应用于肿瘤的基因治疗提供了前提     

3种人肿瘤坏死因子衍生物的研制

本文在详细分析肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）结构的基础上应用ＰＣＲ技术和基因工程手段改造人ＴＮＦ分子,构建了３种人ＴＮＦ的衍生物。３种人ＴＮＦ衍生物是;Ｎ端缺失７个氨基酸且８、９、１０位的ＰｒｏＳｅｒＡｓｐ改为ＡｒｇＬｙｓＡｒｇ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ１）：Ｃ端１５７位Ｌｅｕ改为Ｐｈｅ的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ２）;Ｎ端和Ｃ端同时作上述改变的ＴＮＦ（简写为ｈＴＮＦＤ３）。这３种衍生物在大肠杆菌中均获得较高表述,它们对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性较重组天然人ＴＮＦ有很大升高,尤其是ｈＴＮＦＤ１和ｈＴＮＦＤ３,升高达３个数量级。文中对３种衍生物活性升高的原因作了分析。     

乙肝病毒表面抗原preS1与人肿瘤坏死因子α融合基因的表达

用ＰＣＲ法获得了ＨＢｓＡｇｐｒｅＳ１（１－６５）肽段基因,将该基因融合在肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦα）之后,插入表达载体ＰＳＢ－９２中,使融合基因的５′端直接置于大肠肝菌ＰＬ启动子下游,采用３０℃培养,４２℃诱导,获得了ＴＮＦ与ｐｒｅＳ１（１－６５）融合蛋白的表达产物。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示表达产物为２５ｋＤ,约占细菌总蛋白的３５％。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证,能分别特异地与ｈＴＮＦα抗体与ｐｒｅＳ１抗体结合,稀释复性后,该融合蛋白还具有ＴＮＦ的生理功能（对Ｌ９２９细胞的细胞毒活性）。经ＤＮＡ序列测定,ｐｒｅＳ１（１－６５）肽基因正确地融合在ｈＴＮＦα基因之后。该结果提供了一种制备ｐｒｅＳ１的新方法,为进一步开展治疗肝癌和乙肝的导向药物打下基础。     

hTNF受体在BHK细胞中的表达及其与hTNF—α的相互作用

将两种人肿瘤坏死因子（ｈＴＮＦ）受体ｈＴＮＦＲ５５和ｈＴＮＦＲ７５基因分别克隆到表达载体ｐｃＤＮＡ３、ｐＤＲ２以及ｐＸＪ４１中,以脂质体介导的方法转染ＢＨＫ细胞,用［１２５Ｉ］ＴＮＦα筛选出阳性克隆,并进一步鉴定了表达两种ｈＴＮＦＲｓ的细胞株;反转录（ＲＴ）ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ结果表明两种ｈＴＮＦＲｓ在ＲＮＡ转录和蛋白质合成水平均获得了表达。但ｈＴＮＦα不能引发这些细胞株的细胞毒活性;结合野生型ｈＴＮＦα及其突变体Ｒ２Ｋ的细胞毒活性和体内毒性的测定结果,利用这些细胞株进一步测定了突变体ｈＴＮＦαＲ２Ｋ和野生型ｈＴＮＦα分别与两种受体的竞争结合活性,从而为两种受体以及ｈＴＮＦα的结构和功能研究的进一步深入奠定了一定的基础。     

秦艽体细胞愈伤组织诱导及继代研究

本文报道了秦艽取叶、幼苗为外植体诱导愈伤组织试验。结果表明,取幼苗６７－Ⅴ培养基,２４－Ｄ２５ｍｇ／Ｌ,ＮＡＡ０５ｍｇ／Ｌ,诱导频率最优,可高达１００％。继代培养,以６７％培养基,ＮＡＡ０５ｍｇ／Ｌ,２４－Ｄ（１－１５）ｍｇ／Ｌ最优     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

利用恒溶氧．补料分批技术高密度培养大肠杆菌生产重组人骨形成蛋白-2A

对表达人骨形成蛋白２Ａ（ＢＭＰ２Ａ）的重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＤＨＢ２ｍ在５００ｍｌ摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,继后用５Ｌ自控发酵罐进行分批培养和分批补料培养,以获取ｒｈＢＭＰ２Ａ。两种培养方式结果比较表明,在培养过程中保持３０％～４０％左右的溶解氧和限制性流加葡萄糖可以使ＢＭＰ２Ａ的含量达到２７８ｇ／Ｌ,最终菌体密度为ＯＤ６００５３（相当于干菌２１２ｇ／Ｌ）,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的２５％。该培养技术的关键是：（１）在培养过程中保持适当的溶解氧;（２）限制性流加葡萄糖;（３）４２℃起始诱导的时间控制在对数生长中期,持续表达时间为４ｈ;（４）细菌持续生长的比生长速率控制在０３ｈ１左右。     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL-11生产重组人细胞白介素

在 Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｅ Ｓ１０ 型１５ Ｌ 和 Ｎ Ｂ Ｓ Ｂｉｏ Ｆｌｏ ３０００ 型５ Ｌ 发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒ｐ Ｓ Ｂ Ｈ Ｌ１１ 的大肠杆菌 Ｙ Ｋ５３７ ,生产重组人白细胞介素３（ Ｉ Ｌ３） ,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０ ％ ～４０ ％ 左右、３０ ℃生长１１ｈ ,４２ ℃诱导培养４ｈ ,能将发酵液中最终菌体密度从 Ｏ Ｄ１６６００ 提高到 Ｏ Ｄ５３６００（ 相当于每升发酵液含１０６ 克湿菌体） ,并且保持了白细胞介素３ 的表达量,占菌体总蛋白的３０ ％ 左右,含量超过３３ ％ ｇ／ Ｌ,使 Ｉ Ｌ３ 包涵体产量从湿重２２ｇ／ Ｌ 提高到８５ ｇ／ Ｌ,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到７０ ％ 以上。     

人IL-2/IFNα2b融合基因在肝癌细胞中靶向表达

 根据细胞因子之间协同作用的特点,采用重组 Ｄ Ｎ Ａ 技术设计并构建了人 Ｉ Ｌ ２ 与 Ｉ Ｆ Ｎα融合基因,并用肝癌组织特异的 Ａ Ｆ Ｐ增强子／ Ａ Ｌ Ｂ启动子调控融合基因在肝癌细胞中的靶向表达．实验结果表明,克隆的 Ｅ Ａ Ｆ Ｐ Ｐ Ａ Ｌ Ｂ联合转录调控序列能调控细胞因子基因在 Ａ Ｆ Ｐ阳性人肝癌细胞中靶向表达, Ｉ Ｌ ２／ Ｉ Ｆ Ｎα２ｂ 融合基因的表达水平与感染肝癌细胞的 Ａ Ｆ Ｐ表达水平呈正相关性．实验证明表达的融合蛋白具有 Ｉ Ｌ ２ 和 Ｉ Ｆ Ｎ 两种生物学活性的细胞因子．这可能为肝癌基因治疗开辟新途径．     

SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白

通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况,从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后,生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上,前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍;在 Ｕ９３７ 细胞上,前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明, Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白．     

血管紧张素II和阿片肽对Fos蛋白表达的影响

利用抗体免疫沉淀技术研究了血管紧张素ＩＩ,δ受体激动剂和ｋ受体激动剂对大鼠脑组织ｃ－ｆｏｓ原癌基因表达的影响,结果表明,０．１μｍｏｌ／Ｌ ＡⅡ可显著刺激脑组织中Ｆｏｓ蛋白的表达,０．１μｍｏｌ／ＬＤＰＤＰＥ和０．１μｍｏｌ／Ｌ ＮＤＡＰ对Ｆｏｓ蛋白的表达亦有一定的诱导作用。ＡＩＩ与ＤＰＤＰＥ或ＮＤＡＰ共同处理组织,Ｆｏｓ蛋白表达水平低于ＡＩＩ单独诱导的水平,结果表明阿片肽可抑制ＡＩＩ对Ｆｏｓ蛋白     

三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆,测序及表达

利用跨越内含子的ＰＣＲ技术,从三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）变种ＦＡ１１０中扩增得到Ｄ氨基酸氧化酶基因（ｄａａｏ）,并通过ＴＡ克隆的方法将其克隆至ｐＧＥＭＴ载体。序列测定结果表明,所得ｄａａｏ基因的５′端内含子已被删除,基因总长度为１０７１ｂｐ,它与Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ的Ｄ氨基酸氧化酶同源性达９８３％,与Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ和Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｃｉｌｉｓ的同源性分别是３８９％和３０８％。为提高表达水平,又将此基因转移至高表达载体ｐＥＴ２８ｂ上,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达。经ＩＰＴＧ诱导,目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的４６％,分子量约为３８ｋＤ。Ｄ氨基酸氧化酶的活力可达８０２ｕ／Ｌ。     

重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子的实验室培养、复性和分离纯化

建立了一个实验室制备重组ｈＧＭ-ＣＳＦ的培养、复性和分离纯化的技术工艺。通过对ＰＥＧＭ工程菌的生长和诱导表达等条件的初步调整,使ｈＧＭ-ＣＳＦ的表达量从１６.９％提高到３２.３％,获得０.７４９ｇ／Ｌ的包含体,纯度为６５％;包含体用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍溶解和稀释复性后,经ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ．ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００ＨＲ层析分离,制得纯度达９７％以上、比活性为３.０×１０^７ｕ／ｍｇ的ｈＧＭ-ＣＳＦ,纯化总回收率约为５％     

在大肠杆菌中提高人α1b型基因工程干扰素的表达

将人α１ｂ型干扰素（ＩＦＮ-α１ｂ）基因插入带有原核增强子样序列的新型载体Ｐｂｖ３２２,使干扰素在大肠杆菌中的表达水平明显高于原表达载体,达到１.６×１０^８ｕ／Ｌ培养液。重组质粒的特点是：含增强子序列Ｘ,ｔｒｐ启动子控制。利用ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＣＭ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析及单克隆抗体亲和层析纯化ＩＦＮ-α１ｂ,获得了电泳纯产品,其比活性为２×１０^７ｕ／ｍｇ,分子量为１９ｋＤａ。此外,用Ｐａｔ１５３代替Ｐｂｖ３２２,构建了带有和不带有Ｘ序列的两种表达载体,平行对比表明增强子Ｘ序列可以将ＩＦＮ-α１ｂ表达提高４倍     

重组人α8型干扰素的纯化与鉴定

采用酵母表达载体进行重组人α８型干扰素（ＨｕＩＦＮα８）的表达,该表达菌株可将重组α８型干扰素分泌进入培养基中,回收培养基进行纯化,然后利用超滤浓缩,先过Ｓ．ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱,再进行ＤＥＡＥ-ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析和Ｇ-２５脱盐,最后用高效液相ＨＰＬＣ,ＳＤＳ-ＰＡＧＥ丙烯酰胺凝胶电泳及肽图等方法对纯化产品进行鉴定。采用以上两步纯化方法纯化酵母分泌表达的重组人α８型干扰素纯度可达９５％以上,其比活性为３.０×１０^８ｕ／ｍｇ。     

发根农杆菌A4菌株转化苜蓿悬浮培养物

将苜蓿无菌苗下胚轴切割后,在附加２ｍｇ／Ｌ２,４Ｄ的ＭＳ培养基上诱导愈伤组织。愈伤组织在附加０５ｍｇ／Ｌ２,４Ｄ的ＳＨ培养基中悬浮培养。悬浮培养物在用于转化之前,用０４５ｍｏｌ／Ｌ甘露醇处理１ｈ,然后用０１６ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ洗涤两次。预处理后的悬浮培养物用ＳＨ培养基悬浮（１０ｍｌ／ｇ悬浮培养物）,再加０２ｍｌ农杆菌悬浮液,于２５±２℃共培养２ｄ。共培养的悬浮培养物洗涤后在附加０５ｍｇ／Ｌ羧苄青霉素的无激素培养基上选择培养。悬浮培养天数、悬浮培养基激素组成和选择培养基种类明显影响转化频率。纸电泳分析表明７０％的转化体可以合成农杆碱和甘露碱。染色体观察显示转化组织细胞存在严重的数目和结构变异     

脑源性神经营养因子（BDNF）在成肌细胞中的稳定表达

将ｂｄｎｆ基因克隆入逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建得到ｐＬＮＣ／ＢＤＮＦ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染大鼠成肌细胞Ｌ６ＴＧ,Ｇ４１８筛选２周后,得到稳定表达ｂｄｎｆ基因的细胞克隆Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ。ＤＮＡ印迹结果证实ｂｄｎｆ基因已经整合入Ｌ６ＴＧ染色体中,ＲＮＡ印迹和斑点印迹结果分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白水平证明了ｂｄｎｆ基因的表达,且Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ培养上清中ＢＤＮＦ的含量约为２５ｎｇ（１０６细胞数每ｍｌ每２４ｈ）。     

基因重组人肿瘤坏死因子-α突变体的构建

在详细分析ＴＮＦ α结构及有关ＴＮＦ α结构与功能关系研究的基础上,设计并人工合成了一对ＴＮＦ α结构基因点突变引物。应用ＰＣＲ和分子克隆技术构建了一种新型人肿瘤坏死因子（ＴＮＦ α）分子的编码基因,将该编码基因插入表达质粒,转化大肠杆菌,通过温度诱导获得了表达蛋白,对突变体克隆进行了ＤＮＡ电泳、酶切位点检测以及基因序列测定,并对突变体蛋白进行了ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测。     

墨兰及其杂种的组织培养与快速繁殖

针对墨兰及其杂种常规分株繁殖慢、种子在自然状况下极难萌发的情况,以仙殿白墨及其它与象牙白、西藏虎头兰杂交所得的杂种的胚,仙殿白墨与其杂种Ｆ１代的茎尖、花芽、幼叶、根进行离体培养。结果表明,胚培养以１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５ｍｇ／Ｌ＋１０％椰子汁培养基萌发效果较好,发育到一定时期的早期胚即能萌发;茎尖、花芽培养在ＭＳ＋６－ＢＡ０５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０５ｍｇ／Ｌ＋０５％活性炭培养基上诱导原球茎比较适合,根与幼叶离体培养未诱导出原球茎;根状茎增殖在以花宝一号、花宝二号、蛋白胨等为主要原料并附加０５％活性炭的自制Ｇ３培养基上长得粗壮且繁殖速度快;根状茎出芽诱导在Ｂ５＋６－ＢＡ２～３ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０２ｍｇ／Ｌ＋０５％活性炭培养基上效果最好;生根壮苗以１／２ＭＳ＋ＮＡＡ２０ｍｇ／Ｌ＋１０％苹果汁＋１０％香蕉汁＋１０％活性炭培养基能达到较理想的效果;蔗糖浓度生根培养时以２％较佳,其它培养以３％较好。仙殿白墨杂交种的胚萌发率比仙殿白墨略低,萌发期略长;但其花芽与茎尖的原球茎诱导、根状体增殖、根状茎出芽、生根壮苗培养、生长势、抗逆性等方面均具有杂种优势。     

过量表达的hTR75可独立介导hTNFα的细胞毒性

利用细小ＲＮＡ 病毒属脑炎和心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）的内核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）元件构建了人肿瘤坏死因子受体７５ 基因（ｈＴＲ７５） 和新霉素抗性基因（ｎｅｏＲ）的双顺反子表达载体, 通过电脉冲转染ＢＨＫ２１ 细胞, 筛选出分别和同时稳定过量表达两种ｈＴＮＦ受体的细胞株。这些细胞在ｍＲＮＡ 和蛋白质水平均可检测到ｈＴＲ７５ 的表达。利用野生型和具有两种受体选择性结合活性的ｈＴＮＦα突变体对这些细胞株进行测定, 发现过量表达的ｈＴＲ７５ 可以独立地介导ｈＴＮＦα对ＢＨＫ２１ 细胞的细胞毒性, 而ｈＴＲ５５ 的存在并不能显著增强这种作用。上述结果为进一步阐明ＴＲ７５ 的功能以及两种受体间的相互作用提供了一条新的途径。