人原发性肝内胆管细胞癌中HCV RNA及其NS3区抗原的分布及意义

应用原位分子杂交及免疫组分方法,使用地高辛标记ＨＣＶ５’非编码区探针及抗ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ单克隆抗体,对３５例人原发性肝内胆管细胞癌（ＰＩＣ）和癌旁肝组织的ＨＣＶ ＲＮＡ及其ＮＳ３抗原进行检测结果发现ＨＣＶ ＲＮＡ在ＰＩＣ中的阳性率为８３％,ＨＣＶ ＲＮＡ定位于癌细胞浆中,个别病例并在淋巴细胞、肝窦内皮细胞和枯否氏细胞中发现阳性信号。ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ抗原在ＰＩＣ的阳性率为８９％,阳性     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶的研究进展

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）非结构３区（ＮＳ３）编码的丝氨酸蛋白酶是ＨＣＶ复制过程中的重要蛋白酶,负责对ＮＳ３、ＮＳ４及ＮＳ５进行加工。ＮＳ４ａ是ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶作用的辅因子,并具有多种活性。ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶有相对特异的底物,其活性不能被一般的丝氨酸蛋白抑制剂所抑制。丝氨酸蛋白酶是ＨＣＶ药物设计的靶目标之一。对其结构与功能的研究有着重要意义。     

HCV非结构蛋白(NS2/NS3)基因表达载体的构建及其一级结构分析

应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术,从ＨＣＶ感染者血清中扩增编码ＨＣＶ病毒蛋白酶的ＮＳ２－ＮＳ３ｃＤＮＡ片段,在其５′和３′端分别引入ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ限制性内切酶位点,定向克隆至真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建重组载体ｐｃＤＮＡ－ＮＳ２３,重组表达载体经限制性内切酶消化鉴定．用ＳＰ６和Ｔ７通用引物对目的基因片断进行序列分析．序列同源性分析结果表明,与ＨＣＶ－Ｊ、ＨＣ－Ｃ２有高度的同源性,与ＨＣＶ－１、ＨＣＶ－Ｊ６、ＨＣＶ－Ｊ８同源性差,提示所克隆的基因属ＨＣＶⅡ型．该区内重要的功能位点如Ｚｎ２＋依赖性金属蛋白酶催化中心、丝氨酸蛋白酶催化中心等均高度保守     

新型HCV EIA诊断试剂盒的研制

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组结构区核壳蛋白（Ｃ）区抗原、膜蛋白Ｅ１和Ｅ２区抗原,以及非结构区ＮＳ３－ＮＳ５区抗原的区段,已经在原核细胞中获得有效的表达。同时,相应区段中的优势抗原表位肽也经化学合成法大规模地制备。ＨＣＶ基因组上各区段抗原性的分析发现,由Ｃ区和ＮＳ３区分别编码的Ｃ抗原和Ｃ３３ｃ抗原是ＨＣＶ基因组上两个优势抗原区段。其相应的抗体出现早（感染后６周可检出抗Ｃ３３ｃ抗体）,阳转率高（约９９％阳性检出率）,特异性和重复性均优于其它区段抗原。以中国人ＨＣＶ的Ｃ３３ｃ重组蛋白和分支状合成肽ＭＡＰ－Ｃ－１９为复合抗原,研制了适合我国抗ＨＣＶ抗体检测的新型丙型肝炎病毒酶免疫测定（ＨＣＶＥＬＡ）诊断试剂盒。它同当代美国Ａｂｂｏｔｔ／ＵＢＩＨＣＶＥＬＡ诊断试剂的符合率约９８％,同加拿大ＹＥＳ公司ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的符合率约９７．８％,阳性检出率提高了约２％,３次重复性达１００％,表明其特异性、敏感性和重复性均达到了当代第二代ＪＣＶＥＬＡ诊断试剂的水平。我国人群中抗ＨＣＶ抗体的分布情况为：正常人群的检出率１％－２％;外科类住院病人检出率约２８．８％;肝炎患者抗ＨＣＶ阳性率为３４．４％,慢活肝、肝硬化和重症肝炎患者     

庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究

利用原核表达载体ｐＲＳＥＴ或（和）ｐＧＥＸ在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）Ｃ－ＮＳ３或ＮＳ５区的多段基因。ＣＥ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ５及ＮＳ３－ＮＳ５嵌合基因等的８段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在１０％￣３５％之间。对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中７个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组ＨＧＶ抗原表位的分布,为ＨＧＶ的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定     

噬菌体展示的豆蔻酰转移酶抑制肽序列结构和功能研究

对一个具有很强的抑制豆蔻酰转移酶活性的抑制肽噬菌体所展示的随机区１５肽序列ＴＷＰＶＶＨＧＡＣＲＡＨＧＨＣ进行关键氨基酸残基的单点,双点和缺失等一系列突变研究,以确定其功能区段。结果显示;Ｗ２Ａ,Ｈ６Ｎ和Ｈ６Ｒ突变抑制活性明显下降,Ｐ３Ａ,Ｖ４Ｖ５→Ｖ４Ａ５双点突变对活性也有一定的影响,而Ｖ４Ｖ５→Ｗ４Ｗ５,Ｈ１２Ｎ,Ｈ１４Ｎ,Ｃ９Ｓ,Ｃ１５Ｓ,ΔＣ１５,ΔＨ１４Ｃ１５和Δ９－Ｃ１５等突变对则基本上     

中国丙型肝炎患者中发现新的丙型肝炎病毒核苷酸序列

应用ＲＴ－ＰＣＲ和ＤＮＡ克隆重且技术从中国云南地区丙型肝炎患者血清中克隆到３个丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５?端非编码区（５’ＮＣＲ）核苷酸序列。这３个序列分别来自３个不同的再型肝炎患者。与国内外已发表的ＨＣＶ原型株同源序列比较研究发现,这３个ＨＣＶ５’ＮＣＲ序列中分别存在部分核苷酸序列的缺失或出现插入重复。在ＹＳ２２５－１ ５’ＮＣＲ序列－１５５￣－１７４位之间,有１８个核苷酸序列缺失;在ＹＳ２０３－     

脂多糖对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶基因表达及细胞增殖的影响

应用ＲＮＡ印迹分析和亚硝酸盐含量测定检查脂多糖（ＬＰＳ）对大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）一氧化氮合酶（ＮＯＳ）基因表达及ＮＯ合成的影响,用３Ｈ－ＴｄＲ参入实验观察ＬＰＳ对细胞ＤＮＡ合成的影响．结果表明,ＬＰＳ在诱导ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ表达和促进ＮＯ合成的同时,抑制ＶＳＭＣＤＮＡ合成．证明ＬＰＳ的作用与其浓度和作用时间有关     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒调控基因表达的体外抑制活性研究

为探讨反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒的抑制活性,研究和开发新型抗ＨＣＶ药物。采用ＨＣＶ５’ＮＣＲ调控荧光素酶基因的稳定表达细胞株ＨｅｐＧ２．９７０６,评价了３条针对ＨＣＶ调控基因的ＡＳＯＤＮ,即ＨＣＶ３６３,ＨＣＶ３４９及ＨＣＶ２７９。将Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ包封的ＡＳＯＤＮ与ＨｅｐＧ２．９７０６细胞株每天作用５小时,连续３天后检测荧光素酶活性。     

丙型肝炎病毒PNA打点杂交检测方法同RT—PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５＇端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应检测血清中ＨＣＶ ＲＮＡ折方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异的检出血清中ＨＣＶ ＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法     

青心酮对妊娠高血压综合征胎盘血管内皮和平滑肌细胞内一氧化氮合酶的影响

本文对正常孕妇、妊娠高血压综合征（ＰＩＨ）患者和经青心酮（ＤＨＡＰ）治疗的ＰＩＨ患者等共２４例,应用组织化学分析方法观察胎盘血管内皮细胞（ＶＥＣ）和平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）内一氧化氮合酶（ＮＯＳ）活性的变化。结果表明：正常孕妇胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内ＮＯＳ活性较高;ＰＩＨ胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内ＮＯＳ活性明显减弱,并伴有组织和细胞的形态学损伤;经ＤＨＡＰ治疗后的ＰＩＨ胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ细胞ＮＯＳ活性较未经ＤＨＡＰ治疗者明显增加,其组织和细胞损伤也减轻。本研究结果提示胎盘内ＶＥＣ和ＶＳＭＣ细胞的ＮＯＳ减少可能与ＰＩＨ的发生和／或发展有关,青心酮治疗ＰＩＨ的作用可能与ＤＨＡＰ促进胎盘ＶＥＣ和ＶＳＭＣ内一氧化氮（ＮＯ）合成有关。     

脂多糖对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶基因表达及细胞增殖的影响

应用ＲＮＡ迷分析和亚硝酸盐含量测定检查脂多糖（ＬＰＳ）对大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）一氧化氮合酶（ＮＯＳ）基因表达及ＮＯ合成的影响,用Ｔ３Ｈ－ＴｄＲ参入实验观察ＬＰＳ对细胞ＤＮＡ合成的影响,结果表明,ＬＰＳＤ 诱导ＶＳＭＣｉＮＯＳｍＲＮＡ表达和促进ＮＯ合成的同时,抑制ＶＳＭＣＤＮＡ合成,证明ＬＰＳ的作用与其浓度和作用时间有关。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白辅助T细胞表位研究

对２例ＨＣＶ持续性感染者２个时间点ＮＳ３区Ｃ末端克隆测序,研究ＨＣＶ ＮＳ３蛋白一个辅助Ｔ细胞表位（氨基酸位１２４８－１２６１）在ＨＣＶ感染者体内的保守性;人工合成该表位进行淋巴细胞增殖试验和抑制试验,观察该表位引起免疫应答的水平和特点;通过“刺激－休息－刺激”多轮循环建立该表位特异性的Ｔ细胞系,并用流式细胞仪鉴定表型。结果发现该表位在２个病人２个时间点均未变化;观察的２例ＨＣＶ持续性感染者和１例     

丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究

用ＰＣＲ 方法从丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） ｃＤＮＡ 文库中克隆了两段ＤＮＡ 片段,即ＨＣＶ 基因组非结构ＮＳ３区抗原基因（约０．７ ｋｂ）和核心抗原Ｃ区抗原基因（约０．６ ｋｂ）的ｃＤＮＡ 片段。在两段ｃＤＮＡ 间加入连接肽Ｓｅｒ－ Ｐｒｏ－ Ｇｌｙ－ Ｓｅｒ 的密码子序列,构建成融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ。将该融合基因与衣藻叶绿体基因ａｔｐＡ 的启动子和ｒｂｃＬ 基因的３′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ表达盒,再将该表达盒与选择标记基因ａａｄＡ 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体ｐＳＳ６。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析表明,融合抗原基因ＮＳ３－ Ｃ已整合到衣藻叶绿体基因组中。     

抗旱基因HDCS1的植物表达载体构建

在克隆了二棱大麦第３组ＬＥＡｃＤＮＡ,抗旱基因ＨＤＣＳ１的基因上,将其连接于ｐＢ１１２１的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子之间,,构建了ＨＤＣＳ１的植物表达载体ｐＢＨＣ,并进行了ＰＣＲ和酶切鉴定,为进行植物抗旱基因工程研究创造了条件。     

大鼠隔区一氧化氮合酶阳性神经元的分布和脑缺血后的变化

大鼠隔区一氧化氮合酶阳性神经元的分布和脑缺血后的变化ＤＩＳＴＲＩＢＵＴＩＯＮＡＮＤＩＳＣＨＥＭＩＡＩＮＤＵＣＥＤＣＨＡＮＧＥＳＯＦＮＩＴＲＩＣＯＸＩＤＥＳＹＮＴＨＡＳＥＰＯＳＩＴＩＶＥＮＥＵＲＯＮＳＩＮＴＨＥＳＥＰＴＡＬＡＲＥＡＯＦＲＡＴ关键词大鼠...     

丙型肝炎病毒非结构蛋白3在致病中的作用

本文就近几年有关丙型肝炎病毒非结构蛋白３基因（ＨＣＶｎｓ３）的研究进展分别从该基因的结构功能特点,编码产物（ＮＳ３）的免疫原性等方面作了综述,其中重点介绍了ＮＳ３蛋白与肝细胞癌（ＨＣＣ）发生的相关性研究,对目前有关ＨＣＶ研究体系,临床治疗中存在的问题,新进展也作了简要介绍。     

丙型肝炎病毒RNA打点杂交检测方法同RT－PCR方法的比较

采用ＨＣＶ基因组结构区Ｃ区ｃＤＮＡ探针和非结构区ＮＳ３－４区ｃＤＮＡ探针,建立了用打点杂交（ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法,同采用ＨＣＶ基因组５’端非编码区的一对寡核苷酸引物通过逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测血清中ＨＣＶＲＮＡ的方法相比较,发现两种方法都能快速早期和特异地检出血清中ＨＣＶＲＮＡ,但ＲＴ－ＰＣＲ法敏感性优于ＲＮＡ打点杂交法。对于无血清学指标的慢性ＮＡＮＢ肝炎病人的诊断,可采用这两种方法。这两种方法的敏感性在很大程度上依赖于引物和探针的敏感性,以及ＲＮＡ提取方法。ＲＴ－ＰＣＲ法适用于诊断病毒血症和复制,打点杂交法适用于研究ＨＣＶＲＮＡ量的变化,对治疗的评价,以及为实验筛选较高滴度的ＨＣＶＲＮＡ阳性样本。     

HCVE2／NS1相对保守区多肽体外诱导慢丙肝患者PBMC增殖反应的研究

为了解ＨＣＶ感染后细胞免疫在其中的作用,对３１例慢丙肝及２０例正常献血员以ＭＴＴ法检测外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）对ＨＣＶＥ２／ＮＳ１相对保守区多肽抗原及Ｃ２２、ＮＳ５的增殖反应。结果表明与正常人相比,慢性丙型肝炎患者ＰＢＭＣ对ＨＣＶＣ２２、Ｅ２／ＮＳ１抗原有明显的增殖反应（Ｐ＜００５）,而对ＮＳ５无明显增殖,其中以Ｃ２２抗原性最强。作者认为慢性丙型肝炎患者存在针对与ＨＣＶ相关抗原的细胞免疫,这种细胞免疫不能消除ＨＣＶ感染,而且与疾病的状态无关。     

抗原捕获聚合酶链式反应（AC—PCR）直接分型检测单纯疱疹病毒

用抗单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）型共同性ｇＣ和ｇＤ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,包被Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管,捕捉ＨＳＶ,同时加入３个引物：一个是ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－型共同性上游引物,另两个分别是ＨＳＶ－１和ＨＳＶ－２型特异性下游引物。借此建立了能直接分型检测ＨＳＶ的抗原捕获聚合酶链式反应（ＡＣ－ＰＣＲ）。ＨＳＶ－１的扩增产物为４７７ｂｐ,ＨＳＶ－２的为３９９ｂｐ,两型病毒经ＡＣ－ＰＣＲ扩增后产生分子量不同的ＤＮ