凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌a-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌a-溶血素蛋白为研究对象, 分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异。SDS-PAGE分析检测纯化产物, Bradford法测定蛋白含量, 兔红细胞测定半数溶血效价。结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带, 达电泳级纯度。与此同时, 凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%, 蛋白含量为0.337 mg/mL, 溶血活性为1519 HU/mg; 镍柱亲和层析的纯化率为17.5%, 蛋白含量为0.35 mg/mL, 溶血活性为1463 HU/mg。由此可见, 凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒。     

凝胶过滤与镍柱亲和纯化金葡菌α-溶血素重组蛋白的生物学特性比较

以在宿主菌株BL21(DE3)中成功表达的重组金黄色葡萄球菌α-溶血素蛋白为研究对象,分析比较通过凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography)和镍柱亲和层析纯化试剂盒(Ni-NTA spin columns)纯化所得到的重组蛋白的蛋白含量和生物特性方面的差异.SDS-PAGE分析检测纯化产物,Bradford法测定蛋白含量,兔红细胞测定半数溶血效价,结果显示这2种方法得到的纯化产物在53 kD处均呈现单一清晰带,达电泳级纯度.与此同时,凝胶过滤对目的蛋白的纯化率为14.04%,蛋白含量为0.337 mg/mL,溶血活性为1519 HU/mg;镍柱亲和层析的纯化率为17.5%,蛋白含量为0.35 mg/mL.溶血活性为1463 HU/mg.由此可见,凝胶过滤得到的纯化产物在蛋白含量和蛋白活性方面丝毫不亚于镍柱亲和层析纯化试剂盒.     

茶树叶糖蛋白分离及鉴定的初步研究

茶叶是一种有益健康的保健食品,保健功能在于它有多种化学活性成分。近年来研究表明,茶叶糖蛋白可能是茶叶的保健因子之一。从茶树叶中提取了总蛋白、45%~70%硫酸铵分级总蛋白、分级蛋白Sephadex G-100凝胶层析分离出粗糖蛋白,根据糖蛋白糖链及蛋白的对照染色鉴定出多种茶树叶糖蛋白,并从SDS-胶上快速纯化了三种茶叶糖蛋白。ConA-Sepharose 4B亲和层析从茶树叶总蛋白中分离出16种天然活性糖蛋白。     

番茄凝集素的分离纯化及某些性质的研究

番茄成熟果实经抽提上鸡卵类粘蛋白(OM)-Sepharose 4B亲和层析柱分离纯化制得番茄凝集素。制品在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条带,表观分子量为205,000。Sephadex G200凝胶过滤行为呈单一吸收峰,分子量为180,000。等电聚焦测得等电点为7.6和9.4。它能使人和多种动物红细胞,以及某些培养细胞凝集,但效价不同。N—乙酰葡萄糖胺寡聚糖是其专一性结合糖。     

从无血清连续培养细胞株大量提纯组织型纤溶酶原激活剂

人黑色素瘤细胞无血清连续培养,并运用高效诱导剂,从而快速、大量地获得了含组织型纤溶酶原激活剂(t-PA) 水平较高的培液。经免疫亲和层析、sephadex G-150 凝胶过滤,培液中t-PA得以快速有效地纯化。纯化t—PA为单链形式,分子量67kd,比活性达186,667Iu／mg.从1L培液中可得0．36mg t—PA。以wHO标准t—PA抗体作免疫鉴定,纯化t—PA与标准t-PA免疫性相同。单链t—PA经纤溶酶作用转变为由重链(35kd)和轻链(31kd)组成的双链t—PA。纯化的人黑色素瘤细胞t—PA已成功地用于溶解家兔动脉血栓。     

一种纯化蓖麻毒素的新方法

该文介绍了一种新的提取、纯化蓖麻毒素的方法,首次将P-苯胺基-1-巯基-β-D-吡喃半乳糖苷（P—aminobenzyl-1-thoi-β-D-galactopyranoside）琼脂糖凝胶作为亲和层析介质,结合凝胶层析介质Sephcaryl S-200,通过两步层析纯化,获得了高纯度的蓖麻毒素。MALDI—TOF测得分子量为62925,LD50为12．4μg／kg。该方法可以制备高纯度蓖麻毒素。     

猪血小板外廓蛋白（profilin）的分离纯化和鉴定

本文合成了一种聚脯氨酸亲和层析凝胶,并用这种凝胶纯化了猪血小板外廓蛋白。纯化的外廓蛋白在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一蛋白带,分子量１４ｋＤ;在体外能显著抑制肌动蛋白聚合。     

乌鳢血清免疫球蛋白IgM的分离纯化及其兔抗血清的制备

目的 分离纯化乌鳢血清免疫球蛋白,并制备其兔抗血清。方法 用Protein A亲和层析的方法纯化乌鳢血清免疫球蛋白,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白的纯度,测定其重链、轻链的分子量,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散检测抗血清的效价。结果 纯化了乌鳢血清免疫球蛋白,SDS-PAGE测定其重链和轻链的相对分子质量分别为78×10^3和27×10^3左右,免疫双扩散法测定兔抗乌鳢免疫球蛋白抗血清效价为1∶32。结论 成功纯化了乌鳢免疫球蛋白,制备了兔抗乌鳢IgM抗血清,为研究乌鳢的免疫机制、建立乌鳢的血清学检测系统奠定了基础。     

免疫亲和层析法纯化棕尾别麻蝇(Sarcophagaperegrina)幼虫血淋巴凝集素

 报道了利用免疫亲和层析法纯化棕尾别麻蝇幼虫血淋巴凝集素的结果．哺乳动物红细胞能够特异地吸附凝集素．用兔红细胞与麻蝇幼虫血淋巴凝集素形成的复合体免疫供血家兔,得到麻蝇幼虫血淋巴凝集素的抗体．再利用抗体制备亲和吸附柱,通过免疫亲和层析一次性纯化了麻蝇幼虫血淋巴凝集素． Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ结果显示,该凝集素的分子量约为７３ ｋ Ｄ．这一结果,与用对麻蝇幼虫血淋巴凝集素有抑制作用的糖蛋白—胎球蛋白和甲状腺球蛋白为配基,亲和层析纯化的结果完全相同,表明用这种免疫亲和层析法纯化凝集素是可行的．为不清楚专一性识别糖或专一性识别糖不典型,难于用普通亲和层析纯化的凝集素,提供了一种有效的纯化方法．     

以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血SOD

以魔芋葡甘聚糖（ＫＧＭ）凝胶作为铜金属螯合亲和层析的载体一步亲和纯化猪血ＳＯＤ,得到电泳均一,比活为８６２２Ｕ／ｍｇ,纯化倍数为７７．８倍的ＳＯＤ,其回收率为８５．４％．探讨了魔芋葡甘聚糖凝胶作为亲和载体的可能性及前景．     

人尿激肽原酶的纯化与鉴定

采用两性离子胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的粗提方法,经离子交换、疏水层析、亲和层析及凝胶过滤4个步骤有效地将人尿激肽原酶（hk-1）粗提物纯化,比活提高了1 755倍,总得率为70%.用以慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析纯化hk-1,效果理想,整个工艺路线适合产业化生产.纯化产物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上为单带,高压液相色谱(HPLC)上为单峰,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得分子质量为33 450 u,等电聚焦测得pI在4.3附近,为含糖蛋白.同时测定了该酶的热稳定性和pH稳定性.纯化过程中同时分离得到另一种药用蛋白——人尿胰蛋白酶抑制剂（HUTI）.     

亲和层析纯化HepG_2细胞分泌的PAI－1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性６．１×１０４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡＩ－１活性。用ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析进一步纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯的糖基化ＰＡＩ－１。     

人胎盘酸性β-1,4葡萄糖苷酶的纯化及部分性质

 本文以正常人胎盘为材料,通过匀浆、硫酸铵分级分离、20％正丁醇抽提、Sephadex G-200凝胶过滤及Concanavalin A-Sepharose 4B亲和层析等分离纯化步骤,制备获得了纯化3705倍的酸性β-1,4葡萄糖苷酶,其比活性和获得率分别为277261.33n mol·(mg Prot·h)~(-1)和14.3％。 经agarosn-IEF检验,该纯化的酸性β-1,4葡萄糖苷酶已达蛋白电泳单点纯,PI为5.2。经3～28％梯度PAGE,求知该酶单体分子量为74kD。该纯制酶极不稳定,4℃贮存6天后活性即降低50％以上,与其特异性抗体结合后,活性全部被抑制。     

生物活性肽Lunasin 的原核表达和分离纯化

目的:利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法:将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果:①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论:在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

通用性配体亲和层析

通用性配体亲和层析采用稳定,价廉的简单配体与固相基质连接形成亲和吸附剂,这种吸附剂已广泛应用于蛋白和多肽等的分离纯化。本文介绍三种通用性配体亲和层析方法的基本原理和应用,包括金属整合物配体亲和层析、染料配体亲和层析和组氨酸配体亲和层析。     

生物活性肽Lunasin的原核表达和分离纯化

目的：利用基因工程的方法在大肠杆菌中表达并纯化生物活性肽Lunasin。方法：将合成的Lunasin基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点Nde I和Xho I之间,然后将重组载体转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,利用IPTG诱导表达蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定蛋白的表达。然后利用亲和层析技术将含有6×His标签的蛋白分离纯化、脱盐、冻干。结果：①鉴定结果表明在6kDa位置出现目的条带Lunasin重组蛋白。②亲和层析在100mM咪唑时得到了洗脱的重组蛋白。结论：在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并且纯化出了生物活性肽Lunasin。     

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

半环扁尾海蛇神经毒素的融合表达及活性检测

目的:将海蛇神经毒素基因克隆到融合表达载体pET32a中,诱导表达海蛇神经毒素,鉴定融合表达蛋白的生物功能,为大量合成海蛇神经毒素奠定基础。方法:利用融合表达载体将海蛇神经毒素与硫氧还蛋白融合表达,使其在胞内可溶;采用亲和层析与G50凝胶过滤纯化融合蛋白;利用豚鼠直肠纵肌电刺激检验融合蛋白的神经信号阻断功能。结果:得到电泳纯的融合蛋白,该蛋白对豚鼠直肠纵肌电刺激有明显的阻断作用。结论:融合表达能促进海蛇神经毒素的可溶性表达,表达产物能阻断神经信号的传递。     

重组人β-干扰素的表达、纯化与鉴定

经 1 5L发酵罐制备重组人β 干扰素 (recombinanthumanIFN β,rhIFN β)。以免疫亲和层析方法纯化发酵液中rhIFN β并与蓝谱亲和层析纯化法比较 ,探索快速高效纯化rhIFN β的方法。以ELISA测定rhIFN β含量及经免疫亲和层析纯化的rhIFN β中鼠IgG残留量 ;以PAGE法鉴定rhIFN β的分子量 ;以CPEI法测定rhIFN β的生物活性。取 2L发酵液经免疫亲和层析纯化后 ,得到 3.0 3mgrhIFN β ;经蓝谱亲和层析纯化后 ,得到2 .6 5mg ;分子量为 2 2kD ;沉淀带灰度值分别为 96 .2 %和 95 .1 % ;CPEI比活性分别为 1 .4 3× 1 0 7IU/mg和 1 .6 3× 1 0 7IU/mg ;经免疫亲和层析后纯化物中鼠IgG残留量小于 5 0 μg/L。实验结果表明 ,所采用的免疫亲和层析和蓝谱亲和层析均可快速高效地从酵母菌发酵上清液中分离纯化rhIFN β基因产物